Автореферат (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 2

Для анализа профилей экспрессии использовали ДНК-микрочип Yeast gene expression microarray8 x 15K (Agilent). Для анализа данных экспрессии генов использовали метод построения линейной модели и сравнения значений с помощью модифицированного t-критерия с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественные сравнения,реализованного в пакете limma (Smyth, 2005) для языка R (R Core Team, 2015).Для работы со списками генов использовали Yeastmine (Balakrishnan et al., 2012).Изучение геномной ДНК. Выделение ДНК из клеток бактерий и дрожжей проводили согласно опубликованным методикам (Kaiser et al., 1994; Ladaet al., 2013; Zhang et al., 2013).

Содержание ДНК определяли методом проточной цитофлуориметрии (ПЦМ) на приборе BD FACSIII. Секвенирование продуктов ПЦР и плазмид с использованием капиллярного секвенатора ABI Prism310, а также создание библиотек и секвенирование геномной ДНК с использованием секвенатора Ion Torrent PGM проводили сотрудники Ресурсного центраСПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Полная последовательность команд, использованных для анализа данных полногеномного секвенирования, доступна на странице https://github.com/drozdovapb/code_chunks/tree/master/Peterhof_strains_seq. Сравнительную геномную гибридизацию проводилисогласно опубликованной методике (Zhang et al., 2013).

Данные обрабатывали спомощью CGH-Miner (Wang et al., 2005).Анализ данных. Для обработки счётных данных использовали точныйтест Фишера (см. Dytham, 2011). Для сравнения двух независимых выборок снепрерывной функцией распределения использовали критерий Манна-Уитни; длясравнения более двух независимых выборок применяли критерий Краскела-Уоллиса (см. Dytham, 2011).

Все расчёты проводили с использованием языка программирования R, пакетов base, stats (R Core Team, 2015) и coin (Hothorn et al.,2008).5Результаты и обсуждениеОбщая характеристика особенностей фенотипа и генотипа штамма25-25-2В-П3982Штамм 25-25-2В-П3982 содержит нонсенс-мутации ade1-14 (UGA),his7-1 (UAA) и lys2-87 (UGA), а также супрессорную мутацию sup35-25. Благодаря мутации sup35-25 этот штамм растёт на средах без аденина, гистидинаили лизина (фенотип Isp– ), но может спонтанно утрачивать способность к ростуна средах без гистидина или лизина (фенотип Isp+ ) (рис. 1).YEPD-Ade-His-LysIsp+Isp–Рис. 1 — Клоны Isp+ и Isp– отличаются по интенсивности роста в отсутствие лизинаили гистидина, но не различаются по интенсивности роста в отсутствие аденина.Здесь и далее показаны серии пятикратных разведений.Прежде чем приступить к решению непосредственных задач работы, мыохарактеризовали генотип объекта нашего исследования.

Для этого провели секвенирование геномной ДНК одного изолята Isp+ и одного изолята Isp– . Короткиепрочтения выравнивали на геном референсного штамма S288C, находили позиции, в которых в референсном и изучаемом геноме находятся разные нуклеотиды,и делали вывод о вероятном влиянии таких замен на продукцию и последовательность аминокислот соответствующего белка. Для проверки применимости такогометода мы сравнили полученные данные с известными и обнаружили все ранее описанные в штамме 25-25-2В-П3982 мутации (см. Методы). В случае мутаций, для которых уже было известно конкретное изменение последовательности(ade1-14, his7-1, sup35-25 и sup45-400), мы подтвердили эти данные. Также мыуточнили молекулярную природу некоторых мутаций, для которых было известно фенотипическое проявление и способ получения или тип стоп-кодона, но неконкретное изменение ДНК (thr4-B15, leu2-B2, lys2-87, ura3Δ).

Следовательно,данные полногеномного секвенирования можно использовать для поиска новыхмутаций. Мы более подробно изучили случаи возникновения преждевременногостоп-кодона в кодирующих последовательностях генома изучаемого штамма и обнаружили 46 таких генов, в том числе 21 ген с известной функцией. Таким образом, первичный анализ генома штамма 25-25-2В-П3982 позволил создать массивданных, полезных для интерпретации дальнейших результатов.Сверхпродукция Swi1p, но не других прионогенных регуляторов транскрипции, увеличивает частоту появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp–Ранее были проведены скрининги библиотек, направленные на выявлениегенов, участвующих в детерминации фенотипа Isp+ (Рогоза и др., 2009; Гогинашвили и др., 2009; Rogoza et al., 2010). Наиболее результативным оказался поискс помощью инактивации генов, позволивший выявить SFP1 в качестве структурного гена прионного детерминанта [ISP+ ] (Rogoza et al., 2010). Тем не менее, этотсписок мог быть неполным.

Кроме того, идентификация SFP1 в качестве струк6турного гена [ISP+ ] не исключает участия других генов в поддержании этогодетерминанта.В связи с этим мы провели дополнительную выборочную проверку влияния сверхэкспрессии генов, кодирующих известные прионогенные белки-регуляторы транскрипции: Cyc8, Mot3, Swi1 и Ure2 — на частоту возникновения клоновIsp+ в митотическом потомстве клонов Isp– .

Полученные данные свидетельствуюто том, что сверхэкспрессия SWI1, подобно сверхэкспрессии SFP1, приводит к статистически значимому увеличению частоты появления клонов Isp+ . Для остальных изученных Q/N-богатых белков такого эффекта не обнаружили (рис. 2).↑↑ CYC8n=96∅n=96↑↑ MOT3n=235∅n=237↑↑ SWI1-YFPn=355∅n=286↑↑ URE2***n=96∅n=100↑↑ SFP1n=156∅n=156***0255075100% трансформантовIsp+ иIsp–Рис. 2 — Сверхэкспрессия гена SWI1 приводит к увеличению частоты возникновения клонов Isp+ по сравнению со спонтанным уровнем. ∅ — контрольная плазмида ссоответствующим селективным маркером. n — общее число проверенных трансформантов.*** — < 0,001 (точный тест Фишера с поправкой Холма).Можно предложить ряд возможных механизмов влияния SWI1 на изучаемый признак: (i) изменение фенотипа связано с возникновением приона [SWI + ];(ii) взаимодействие Swi1p и Sfp1p приводит к агрегации последнего за счёт коагрегации или конкуренции за шапероны; (iii) сверхэкспрессия SWI1 приводит кувеличению экспрессии SFP1, в результате которого и возникают клоны Isp+ .Для проверки первых двух предположений достаточно выяснить, сохраняется ли эффект в условиях заведомого отсутствия приона [SWI + ] и вообщеагрегации белка Swi1.

Известно, что для поддержания приона [SWI + ], как и большинства других прионов, необходим шаперон Hsp104 (Du et al., 2008), в то времякак детерминант [ISP+ ] способен поддерживаться в отсутствие Hsp104 (Volkovet al., 2002), а в клетках с делецией HSP104 можно индуцировать возникновение [ISP+ ] с помощью сверхэкспрессии SFP1 (Rogoza et al., 2010). Мы удалилипоследовательность гена HSP104 в изоляте Isp– и обнаружили, что влияние сверх7экспрессии SWI1 на частоту появления клонов Isp+ сохраняется. Следовательно,наблюдаемый эффект не связан с возникновением приона [SWI + ].Тем не менее, возможно, что на изучаемый феномен влияет возникновение неприонных агрегатов белка Swi1, которые могут прямо или косвенно влиятьна агрегаты Sfp1.

В литературе описана конструкция SWI1QC, кодирующая белокSwi1, лишённый N-концевого аспарагин-богатого участка. Такой белок функционален, но не способен к агрегации (Du et al., 2010). Мы выяснили, что сверхэкспрессия SWI1QC-YFP, подобно сверхэкспрессии SWI1-YFP, приводит к статистически значимому увеличению частоты возникновения клеток Isp+ в потомстве трансформантов. Совокупность полученных данных позволяет заключить,что повышенная частота появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp– послесверхэкспрессии SWI1 не связана с агрегацией белка Swi1.Для проверки гипотезы о влиянии сверхпродукции Swi1p на уровень экспрессии SFP1 мы воспользовались методом количественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и выяснили, что уровень мРНК SFP1 не изменяется (рис. 3).

Следовательно, механизм появления клонов Isp+ при сверхпродукциибелка Swi1-YFP не связан с усилением экспрессии SFP1.ΔCq (относительно ACT1)Уровень мРНК SFP1****YFPSFP1Рис. 3 — Сверхэкспрессия SWI1-YFP неприводит к изменению уровня экспрессии SFP1. Показаны результаты ОТ-ПЦРРВ. РНК выделена из трансформантов Isp–плазмидами p426GPD-YFP, pRS426-SFP1или p426GPDSWI1YFP. Каждая точка соответствует одному независимому клону; линия — медианный уровень. ** — < 0,01(попарный критерий Манна-Уитни с поправкой Холма).SWI1-YFPСледует отметить ещё одну схожую черту сверхэкспрессии SFP1 и SWI1,кроме увеличения частоты возникновения клонов Isp+ : в обоих случаях наблюдали снижение скорости роста колоний трансформантов. Тем не менее, в случае сверхэкспрессии конструкций SWI1-YFP или SWI1QC-YFP мы обнаружилиотдельные большие колонии (рис.

4А), которые не были отмечены при сверхэкспрессии SFP1. Такие колонии появлялись при трансформации как изолятов Isp– ,так и изолятов Isp+ .Последующий анализ крупных колоний показал, что большинство такихклонов не способно скрещиваться (рис. 4Б) и представлено более крупными посравнению с исходным клоном клетками (рис. 4В). Последние два обстоятельствапозволяют предположить, что появление крупных колоний объясняется автодиплоидизацией клеток.

Для проверки этого предположения мы воспользовалисьметодом проточной цитофлуориметрии (ПЦМ) с предварительной окраской ДНКи обнаружили, что такие клоны действительно представлены клетками с диплоидным набором ДНК (рис. 4В).8А ↑↑SWI1-YFPБBMATa MATαГ 1С2С 4СКонтрольМелкиеколонии10 мкмКрупныеколонииРис. 4 — Крупные колонии при сверхэкспрессии SWI1-YFP возникают в результатедиплоидизации клеток. А — Трансформанты изолята Isp+ плазмидой p426GPDSWI1YFPна 5-й день инкубации.

Б — результаты анализа типа спаривания потомков этих трансформантов и исходного клона. MATa и MATα — тестерные штаммы для проверки типа спаривания. Б — микрофотография жидких культур отмеченных клонов. В — результаты анализаэтих культур методом ПЦМ. Числа C соответствуют отношению медианы соответствующего пика к медиане наименьшего пика, округлённому до целых.Таким образом, сверхэкспрессия SWI1 в клонах фенотипа Isp– может приводить к одному из трёх событий: сохранению исходного фенотипа, появлениюдиплоидных клонов супрессорного фенотипа и появлению клонов Isp+ , по фенотипу не отличимых от возникших спонтанно или при сверхэкспрессии SFP1.Вопрос о том, одинаковы ли механизмы, приводящие к смене фенотипа с Isp–на Isp+ при сверхэкспрессии SFP1 и сверхэкспрессии SWI1-YFP, пока остаетсяоткрытым.В клонах Isp+ и Isp– различается экспрессия только единичных генов рибосомных белков и биогенеза рибосом, и эти различия не определяют разницув их фенотипеРанее была высказана гипотеза о том, что причиной снижения эффективности нонсенс-супрессии в изолятах Isp+ является прионизация Sfp1p (Rogozaet al., 2010).