Автореферат (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae)

На правах рукописиДроздова Полина БорисовнаАНЕУПЛОИДИЯ КАК МЕХАНИЗМ ОБРАТИМОГОИЗМЕНЕНИЯ СУПРЕССОРНОГО ФЕНОТИПА (ISP)У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAEСпециальность 03.02.07 —«Генетика»Авторефератдиссертации на соискание учёной степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург — 2017Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университетеНаучный руководитель:Доктор биологических наук, доцентГалина Анатольевна Журавлевапрофессор кафедры генетики и биотехнологии,Санкт-Петербургский государственный университетОфициальные оппоненты:Доктор биологических наукВладимир Геннадьевич Королев,Заведующий лабораторией генетики эукариот Федерального государственного бюджетного учреждения«Петербургский институт ядерной физики им. Б.

П.Константинова», Национального исследовательскогоцентра «Курчатовский институт»Кандидат биологических наукВладимир Александрович Жуков,Заведующий лабораторией генетики растительномикробных взаимодействий Федерального государственного бюджетного научного учреждения«Всероссийский научно-исследовательский институтсельскохозяйственной микробиологии»Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное научноеучреждение «Институт экспериментальной медицины»Защита состоится « »2017 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.212.232.12 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.

7/9, Санкт-Петербургскийгосударственный университет, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. ГорькогоСанкт-Петербургского Государственного университета и на сайте СПбГУ(https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/JyYZJY5Z7d.pdf).Автореферат разослан« »Ученый секретарьдиссертационного советаД.212.232.12,доктор биологических наук2017 г.Людмила Андреевна МамонОбщая характеристика работыАктуальность темы исследования.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae —модельный эукариотический объект, с помощью которого можно исследовать механизмы многих процессов в клетке. Одним из таких процессов является терминация трансляции. Известно, что её эффективность зависит от различных факторов. Снижение эффективности терминации приводит к нонсенс-супрессии —считыванию стоп-кодонов как значащих. Исследование посвящено дальнейшемуизучению механизмов, обеспечивающих тонкую регуляцию эффективности терминации трансляции у дрожжей, с использованием модели нонсенс-супрессии.Степень разработанности темы.

Ранее было показано, что штаммы,несущие нонсенс-супрессорную мутацию sup35-25 (ген SUP35 кодирует фактортерминации трансляции eRF3), способны к спонтанному изменению фенотипа ссупрессорного на несупрессорный. Природа возникающего несупрессорного фенотипа была подробно исследована: было показано, что в основе этого измененияфенотипа лежит появление в клетке наследственного детерминанта, обозначенного [ISP+ ] (от англ. Inversion of Suppressor Phenotype) и проявляющего сходство сдрожжевыми прионами. Было показано также, что [ISP+ ] возникает, скорее всего,в результате прионного превращения транскрипционного фактора Sfp1. Вместес тем, не вполне понятно, каким образом прионизация этого транскрипционного фактора может приводить к снижению эффективности нонсенс-супрессии, тоесть к увеличению эффективности терминации трансляции.Целью работы явилось дальнейшее изучение механизмов, лежащих в основе обратимого изменения супрессорного фенотипа (Isp) у дрожжей S.

cerevisiae.В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:1. Изучение влияния сверхэкспрессии генов, кодирующих известные прионногенные регуляторы транскрипции, на частоту появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp– ;2. Сравнение изменения экспрессии генов, сопровождающего переход от фенотипа Isp+ к фенотипу Isp– , с изменением экспрессии, вызванным делециейSFP1;3. Поиск генов, изменение уровня экспрессии которых может определять разницу фенотипов Isp+ и Isp– ;4. Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp– , направленныйна выявление особенностей, коррелирующих с фенотипом клона.Научная новизна.

В представленной работе впервые показано, что эффективность нонсенс-супрессии может регулировать дупликация хромосомы II,несущей супрессируемые мутации his7-1 и lys2-87. Кроме того, впервые обнаружено, что при воздействии гидрохлорида гуанидина может происходить отборанеуплоидных клонов, а под действием сверхэкспрессии SFP1 — возвращение кэуплоидному состоянию. Впервые показано влияние сверхэкспрессии SWI1 накариотип гетероталличного штамма.3Теоретическая и практическая значимость работы. Представленнаяработа является целостным исследованием, сочетающим подходы молекулярнойгенетики и современных методов анализа данных. Полученные данные подчёркивают необходимость учёта дополнительных изменений генома, таких как анеуплоидия, при планировании исследований, непосредственно не связанных с изучением стабильности генома.

Эти результаты углубляют понимание механизмовтонкой регуляции матричных процессов и могут быть использованы в курсах«Частная генетика дрожжей», «Генетический контроль трансляции» и «Прионы»,преподаваемых на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, а также аналогичных курсах в других учебных заведениях.Методология и методы исследования.

В данной работе использованподход, объединяющий методы, традиционно используемые в генетике дрожжей, широкий круг методов молекулярной биологии и микроскопии, а также современные методы биоинформатики. Основной объект исследования — дрожжиS. cerevisiae.Основные положения, выносимые на защиту. В изученной системекопийность хромосомы II может регулировать нонсенс-супрессорный фенотип:все изученные клоны фенотипа Isp– характеризуются наличием дополнительнойхромосомы. Кроме того, некоторые клоны Isp– характеризуются также наличиемдополнительной хромосомы IX и снижением экспрессии генов, контролирующих импорт ионов железа и метаболизм аминокислот. Все изученные клоны Isp+содержат одну хромосому II; некоторые из них являются дисомиками по другим хромосомам, но это не влияет на эффективность нонсенс-супрессии.

Разницафенотипа между клонами Isp+ и Isp– частично объясняется дупликацией генов,являющихся мишенью нонсенс-супрессии, а также может усиливаться за счётувеличения дозы других генов, кодирующих участвующие в трансляции белки иРНК. Токсическое действие гидрохлорида гуанидина может способствовать отбору дисомных по хромосоме II клонов, а сверхэкспрессия генов SFP1 или SWI1,напротив, приводить к нормализации кариотипа таких анеуплоидных клонов. Вслучае сверхэкспрессии SWI1 может также происходить диплоидизация клеток.Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 9 российских имеждународных конференциях и опубликованы в 5 статьях в рецензируемых научных изданиях.Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глави пяти приложений. Полный объём диссертации составляет 193 страницы с 57рисунками и 20 таблицами.

Список литературы содержит 336 наименований.4Содержание работыМетодыШтаммы и условия культивирования. В работе использован рядштаммов S. cerevisiae, в первую очередь различные производные штамма25-25-2В-П3982 генотипа МАТa ade1-14 his7-1 lys2-87 ura3∆ leu2-B2 thr4-B15sup35-25 sup45-400 (Аксенова и др., 2006). Далее в работе изоляты этого штамма,имеющие фенотип Isp+ , обозначены буквой p, а изоляты фенотипа Isp– — буквойm и пронумерованы в порядке их получения. Для амплификации плазмид использовали штамм DH5α Escherichia coli (Hanahan, 1985).

Для культивированиядрожжей и бактерий и анализа фенотипа дрожжей использовали стандартныесреды (Захаров и др., 1984, Kaiser et al., 1994) с необходимыми модификациями. Использованы стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984,Kaiser et al., 1994, Gietz et al., 1992) и генетической инженерии (Sambrook et al.,1989) с необходимыми изменениями.Анализ экспрессии генов. Выделение РНК проводили с использованиемкоммерческих реактивов согласно указаниям производителя.