Диссертация (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 9

№ 123-1334);Скорость подачиДеление потокаТемпература колонки:::Газа-носителя(гелий)–1,5мл/мин;10 : 1;температура термостата колонки начальная 40ºСвтечение 3 мин, подъем температуры до 200ºС соскоростью 20ºС/мин;Температура инжектораДетекторТемпература парофазногоанализавремяпарофазногоанализа,Температура петлиТемпературалиниипереносаВремя заполнения петлиВремя инжектирования:::250 °С;ПИД, 300°С;100 °С;:15 мин;::105 °С;110 °С;::0,10мин;0,05мин;50Объем вводимой пробыВремяхроматографическогоанализа:1,0 мл;15мин;Время удерживания этанола - 4,48мин.Методика:Хроматографируютиспытуемыйраствор3раза,регистрируют хроматограммы, измеряют площади пиков растворителей(табл.2.5)Содержание этанола в субстанции (Х) в процентах рассчитывают поформуле:Х =S  а0  Р;S0  аS – площадь пика этанола на хроматограммеиспытуемого раствора;S0 –площадь пика этанола на хроматограмме растворасравнения;а – навеска экстракта I.viscosa, мг;а0 – навеска стандартного образца этанола, мг;Р – содержание основного вещества в стандартномобразце этанолаОписание, определение содержания сухого остатка и тяжелых металловгде:проводилось в соответствии с ОФС.1.4.1.0021.15 «Экстракты».

Суммарноесодержание тяжелых металлов в жидком экстракте определяли методом 2 поОФС 1.2.2.2.0012.15. Определение плотности экстракта было проведено всоответствии с ОФС.1.2.1.0014.15 «Плотность» - метод 3.ОпределениеpH10%водногоизвлечениягеляпроводилипотенциометрически на pH-метре «Mettler Toledo» S 80-K в соответствии стребованиямиОФС.1.2.1.0004.15«Ионометрия,пункт3–Потенциометрическое определение pH».Определение вязкости образцов геля осуществляли на ротационномвискозиметре «Rheotest-2» типа RV (ГДР) согласно методике прибора намалом цилиндре с объемом тестируемой пробы 25 мл.

каждый образецтестировался троектратно с интервалом времени 20 мин при 20°С. Показанияприбора снимали в диапазоне скоростей сдвига от 0,333 до 145,8 об/с (по 1251позициям) от меньшего к большему и обратно. Полученные показанияобрабатывались по разработанной авторской программе «Rheotest».Касательное напряжение сдвига:τ = z • α,где:τ- касательное напряжение, н/м;α – показание прибора, дел;z - константа цилиндра, н/(м хдел).Динамическая вязкость:η = τ /Dr,η – динамическая вязкость, Па·с;где:τ - касательное напряжение, н/м;Dr - градиент скорости сдвига, с -12.2.4.4 Методика оценки фармацевтической доступности БАС из«Жэтривис-гель»Предварительнаяоценкаадекватностисоставаитехнологииразработанного препарата, основана на изучении кинетики высвобожденияфлавоноидов из «Жэтривис-гель». Традиционно, с этой целью используютметод (in vitro) равновесного диализа через полупроницаемую мембрану (поКрувчинскому) [39,42].Используемый прибор состоял из герметичной стеклянной емкости сдиализной средой, в которую помещается стеклянная трубка.

Опущенный вдиализную среду конец трубки, закрывали специальной диализной мембранойс размером пор 12-14 кДа и площадью 10 см2, а на мембрану внутри трубкипомещали навеску «Жэтривис-гель» массой около 0,5г. В качестве диализнойсреды использовали 70% спирт объемом 30 мл (исходя из возможностиколичественногоопределениясуммыдействующихвеществ),притемпературе 25 0С. Через каждые 5 минут проводили отбор проб диализата по1 мл, объем отобранной аликвоты восполняли новой порцией средывысвобождения.Методика определения фармацевтической доступности из «Жэтривисгель» суммы флавоноидов: в мерную колбу на 10 мл помещают 1 мл диализатаи диализной средой доводят до метки (раствор А). Далее действуют согласноразработанной методике, изложенной в п.3.6.252Количество выхода действующих веществ из «Жэтривис-гель» вдиализную среду в пересчете на рутин в процентах (Х) определяли поформуле:=1 ×0 ×200 × Результатыгде:– оптическая плотность испытуемогораствора;0 - оптическая плотность раствора СО рутина;0 – навеска СО рутина, г; – навеска «Жэтривис-гель», г.оценкифармацевтическойдоступностисуммы1действующих веществ по разработанной методике представлены в главе 4.2.2.5 Методы определения биологических свойств БАС I.viscosa,«Жэтривис» и «Жэтривис-гель»2.2.5.1 Методика скрининга биологической активности in silicoВ качестве испытуемых использовались соединения, присутствиекоторых в составе экстрагируемых БАС подтверждено литературнымиисточниками.

Биологическая активность была спрогнозирована с помощьюпрограммного продукта PASS (Prediction Activity Spectra for Substances) [12].С помощью этого инструмента можно определить количественную связьструктура-активность на основе разложения химических структур в 2D и/или3D дескрипторах.Результаты принимались во внимание в случае, если возможностьпроявления эффекта (Ра) демонстрировалась выше 50% (Ра>0,5), а также былавыше потенциальной невозможности проявления активности (Pa>Pi).2.2.5.2 Методика оценки противовоспалительной активности спомощью СФБТСДля оценки противовоспалительной активности образцов жидкогоэкстракта использован относительно новый, но перспективный метод in vitroпо ингибирующему влиянию БАС, обладающих противовоспалительнымисвойствами,наскоростьферментативнойреакции,катализируемую53индуцибельной NO-синтазой (ферментом-iNOS).

Препарат индуцибельнойNO-синтазы(iNOS),полученнойизмышиныхмакрофагов,экспрессированных E. Coli Sigma-Aldrich (США) использовали в качествереагента, в буферном растворе 50 мМ HEPES pH 7,4 с 1мМ ацетатом магния.Скорость iNOS-реакции определяли по изменению поглощения НАДФН(раствора продуктов реакции) при 340 нм и 370С на спектрофотометреShimadzu U-1800 (Япония). Ферментативную активность iNOS, измеряли до(в контроле) и после (опыт), добавления в реакционную среду 20 мкл растворажидкого экстракта.Полученные результаты обрабатывали статистически, вычисляя M ± m,где M – средняя арифметическая величина; m – средняя квадратичная ошибкасредней арифметической величины.

Величина m в опытах составила ± (3 -5)%.2.2.5.3 Микробиологические исследованияМетодика определения микробиологической чистоты осуществлялась всоответствии с требованиями ОФС 1.2.4.0002.15 «Микробиологическаячистота» [11]. Для количественного определения аэробных микроорганизмовиспользовали мембранные фильтры с размером пор – 0,22 мкм, диаметром 90мм (ФИЛЬТР-ГАРАНТ, Россия) и микробиологичеcкие экспресс-тесты(Биоконтроль, Россия).Для нейтрализации антимикробного действия БАС I.viscosa пропускалине менее 3 порций по 100 мл стерильной промывной жидкости (0,9% растворнатрияхлоридарН 7,0 ±0,2 (послестерилизации)) ссоставом,соответствующим требованием ОФС.Трава I.viscosa и жидкий экстракт травы I.viscosa 1:1 должнысоответствовать требованиям категории 4Б - лекарственные растительныепрепараты и лекарственное растительное сырье, приготовленные безиспользования кипящей воды.«Жетривис-гель» должен соответствовать требованиям категории 2.54Изучениебактериостатическойифунгистатическойактивностипроводили методом двукратных серийных разведений образцов жидкогоэкстракта I.viscosa в жидких питательных средах в опытах in vitro.Микроорганизмы: патогенные грамположительные St.aureus 209-P(АТСС 6538), грамотрицательные E.сoli ATCC 25922, Pr.vulgaris ATCC 6896и Ps.aeruginosa АТСС 9027, мицелиальные грибы Microsp.canis 252 идрожжеподобные грибы C.albicans АТСС 10231.Среды:мясо-пептонныйбульон(МПБ)-дляопределениябактериостатической активности; жидкая среда Сабуро - для определениифунгистатической активности.Методики:Оценка бактериостатической активностиВ ряду пробирок, содержащих по 2 мл среды МПБ, начиная с первой, вкоторую внесли 2 мл испытуемого образца, получив разведение 1:2.

Затем,последовательно разбавляя «Жэтривис» в питательной среде в 2 раза получалиряд разведений. В последней оставлена чистая среда - контроль. Послеприготовления разведений, культуры микроорганизмов были засеяны впробирки.В растворе натрия хлорида 0,9% готовили взвеси грам+ и граммикроорганизмов бактерий по бактериальному стандарту мутности ОСО 4228-85-2014 (10 МЕ) (109 микр.тел/мл). Путем десятикратных разведений в0,9% растворе натрия хлорида начиная с первой пробирки, содержащей 109микр.тел/мл, получали убывающие концентрации микроорганизмов: 108, 107106, 105, 104.

Затем, в каждую пробирку, вносили по 0,2 мл взвеси, содержащей104 микр.тел/мл. Посевы инкубировали при 37°С - 24 часа.Определение фунгистатической активностиВ ряду пробирок, содержащих по 2 мл среды Сабуро, начиная с первой,в которую внесли 2 мл Жэтривис», получили стартовое разведение 1:2. Рядубывающих разведений получен путем разведения 2 раза образца в55питательной среде. В последней пробирке – контроль – чистая среда. Всепробирки с разведениями и контроль засевали культурами микроорганизмов.Взвесь грибов, в растворе натрия хлорида 0,9% по бактериальномустандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) (109 микр.тел/мл), разводилираствором натрия хлорида 0,9% в 20 раз. Все пробирки засеяли полученнойвзвесью по 0,2 мл. Инкубировали при +30-32°С: мицелиальные грибы − 10–14суток, дрожжеподобные грибы – 48 часов.Все опыты проводили в трех повторностях.Бактериостатический и фунгистатический эффект определяли поминимальному, подавляющему рост микроорганизмов разведению экстрактаI.viscosa, при котором визуально не наблюдали образования колоний.2.2.5.4 Определение биологической активности in vivoЭкспериментыпоопределениюбиологическойактивностиналабораторных животных проведены на базе отдела экспериментальнойфармакологии ФГБНУ ВИЛАР в соответствии с правилами, установленнымиприказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.

«Об утверждении правиллабораторной практики». ФЗ №61 «Об обращении лекарственных средствах»(статья 11), «Руководством по проведению доклинических исследованийлекарственных средств» (Москва, 2012). Источник животных – филиал«Андреевка» ФГБУН «НЦБТ» ФМБА России (Московская область).Животные содержались в виварии ФГБНУ ВИЛАР на стандартном рационе.[36].2.2.5.4.1методикаоценкивлияния«Жэтривис»натечениеэкссудативной фазы острого воспаления при трёхдневном введенииЭксперимент проведен на 40 белых нелинейных мышах (самцы массой30,0г).Дляоценкипротивовоспалительнойактивности«Жэтривис»использовали методику, согласно которой, изучаемый препарат вводили56подопытным животным внутрижелудочно в течение 3 дней.