Диссертация (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 8

Извлечение охлаждают, фильтруют в мерную колбу на 50 мл черезбумажный (синяя лента) складчатый фильтр, доводят объём 70 % спиртом дометки (Испытуемый раствор). Испытуемый раствор - 0,5 мл в мерной колбе на50 мл доводят 70% спиртом до метки и перемешивают (раствор А). Спектрпоглощения раствора А снимают на спектрофотометре в диапазоне волн 200500 нм при толщине поглощающего слоя 10 мм.Для разделения и идентификации веществ использовали методхроматографии в тонком слое сорбента с помощью пластинок (силикагель наалюминиевой подложке с индикатором, флуоресцирующим при 254 нм) Fluca(Merck, Германия). ТСХ проводили в подвижной системе н-бутанол–ЛУК–вода (4:1:1).

Зоны адсорбции визуализировали с УФ -лампой при длине волны365 нм до и после обработки хроматораммы реагентами: вначале растворомдифенилборилоксиэтиламина,затемрастворомполиэтиленгликоля-400.Испытуемый раствор наносили на ТСХ одновременно со стандартнымирастворами в этаноле аутентичных веществ, каковыми были: рутин, кофейнаякислота, галловая кислота, хлорогеновая кислота.2.2.2.2. Методика фракционирования БАС целевого фрагментаметаболома I.viscosa в различных растворителяхНавеску 10,0 г измельченного (не более 3 мм) сырья I.viscosa,экстрагировали спиртом 70% в соотношении 1:10 на кипящей водяной бане собратным холодильником в течение 1 часа 5 раз.

Извлечения объединяли,фильтровали, отгоняли спирт в вакууме. Полученный водный остатокохлаждали фильтровали через бумажный (синяя лента) складчатый фильтр.45Фильтрат экстрагировали равным количеством хлороформа 8 раз,каждыйразвделительнойворонкеотделялиорганическийслой.Хлороформные порции после объединения обезвоживали натрия сульфатом.Из водного остатка при нагревании на кипящей водяной бане вширокогорлой колбе под тягой удаляли хлороформ.Согласно вышеописанному приему были получены извлечения спомощью этилацетата и бутанола.Смолообразные остатки, полученные после упаривания органическихизвлечений в вакууме, использовали для дальнейшего изучения.

Блок – схемафракционирования БАС травы I.viscosa представлена на рисунке 2.1.Экстракция70% спиртСырьеВодно-спиртовоеизвлечениеОтгон спирта при температуре 50-60 С0 при разряженииФильтрование водного извлеченияФракционирование водного остатка (последовательное экстрагирование)хлороформэтилацетатбутанолВодныйостатокРисунок 2.1. Схема фракционирования БАС травы I.viscosa по ихрастворимости в различных растворителях2.2.2.3 Изучение фитохимического состава травы I.viscosa методомУВЭЖХ/МСДля анализа состава полифенольных соединений (кислот, флавоноидов)и других компонентов извлечений из сырья I.viscosa использован методУВЭЖХ/МС.По 1 мл образцов органических фракций: хлороформной, этилацетатнойи бутанольной обработали на центрифужном испарителе (Speed Vac), остаток46растворяли в 70% спирте при 600С в течение 15 мин на шейкере 800 об/мин.Тщательно центрифугировали все 3 раствора при 14000 об/мин в течение 30мин.

Супернатант анализировали методом УВЭЖХ/МС.Анализ проводили на системе Acquity UPLC фирмы «Waters» (США) сдетекторами PDAи TQD. Использовали стальную колонку размером 2,1×150мм с сорбентом Acquity BEH C18 - частицы 1,7 мкм при температуре 35°С собъемом инжекции - 1 мкл.В качестве ПФ использовали А: смесь муравьиная кислота-вода, Б:муравьиная кислота-MeCN - 0,78:1000 со скоростью подачи элюента 0,3мл/мин. (табл.2.2)Условия анализа:Таблица 2.2 – Условия хроматографированияSolventSolventGradientTableA:B:Time (min)1234Initial3030.134Flow Rate,мл/мин0.30.30.30.3Formic Acid 20mM-WaterFormic Acid 20mM- MeCN%A%BCurve9550959555055666Таблица 2.3 - Условия детекции в режиме регистрации позитивных ионовPolarityCapillary(kV)Cone (V)Extractor (V)RF (V)Source Temperature (°C)Desolvation Temperature (°C)Cone Gas Flow (L/Hr)Desolvation Gas Flow (L/Hr)ES+3.55040.512045050800Таблица 2.4 - Условия детекции в режиме регистрации негативных ионовPolarityCapillary(kV)Cone (V)Extractor (V)RF (V)Source Temperature (°C)Desolvation Temperature (°C)Cone Gas Flow (L/Hr)Desolvation Gas Flow (L/Hr)ES3-50-40.212045050500472.2.2.4 Методика определения качественного состава летучихкомпонентов I.viscosaСостав летучих компонентов сырья I.viscosa исследовали с помощьюхромато-масс-спектрометре Varian 450GC-220MS с масс-анализатором типа«ионная ловушка» методом газожидкостной хроматографии с массспектрометрическим детектированием (ГЖХ-МС).Навеску сырья бережно (для более полного сохранения летучихкомпонентов) экстрагировали 70% (по объему) спиртом при комнатнойтемпературе в течение 5 дней при соотношении сырьё-экстрагент 1:50.

Кизвлечению добавляли н-гексан в соотношении 1:2, экстрагировали, отделялигексановую фракцию. Гексановый раствор служил в качестве испытуемогораствора.С помощью кварцевой капиллярной колонки (FactorFOUR VF-5ms(30м×0,25 мм)) проводили хроматографическое разделение компонентов, сиспользованием в качестве газа-носителя – гелия при постоянной скоростипотока 1,0 мл/мин. Объем инжектируемой пробы 1 мкл при температуре 200°С(деление потока 15).

Температурная программа колонки: 5 мин – 50°С, нагревсо скоростью 5°С/мин до 110°С, 2 мин изотерма, нагрев со скоростью10°С/мин до 240°С, 15 мин изотерма при 240 °С.С помощью библиотеки масс-спектров NIST Version 2f и алгоритмовсравнения ПО Saturn (Varian) проводили идентификацию разделенныхкомпонентов. Идентифицированные соединения количественно оценивалиметодом нормализации по площади пиков (полный ионный ток) иавтоматической системы обработки.2.2.2.5 Методика определения эфирного маслаОпределение содержания эфирного масла проводилось согласнотребованиям ОФС.1.5.3.0010.15 «Определение содержания эфирного масла влекарственномрастительномсырьеилекарственныхпрепаратах» по методу 1.

Масса навески сырья 100,0 г. [11]растительных482.2.3 Стандартизация сырья I.viscosa, жидкого экстракта и геляРазработка методики определения содержания фенольных соединений всырье I.viscosa проводилась с использованием метода УФ-спектрофотометриив пересчете на хлорогеновую кислоту.Разработка методики количественного определения суммы флавоноидовоснована на СФМ - определении продуктов реакции с реагентом батохромногосдвига алюминия хлоридом в среде 70% спирта [4].

Данный метод, согласнопринципу сквозной стандартизации, использован для разработки методики всырье I.viscosa, жидком экстракте и геле на его основе.СпектрывУФ-областирегистрировалисиспользованиемвышеуказанного прибора в п. 2.2.2.1.Валидацияметодикколичественногоопределенияпроведенавсоответствии с ОФС 1.1.0012.15 «Валидация фармакопейных методов». [11]отчеты о валидации представлены в приложениях 5,6,10.2.2.4 Технологические методы исследования2.2.4.1 Методики определения технологических характеристиктравы I.viscosaОпределение сыпучести измельченного растительного сырья проводилив соответствии с ОФС.1.4.2.0016.15 «Степень сыпучести порошков» нааппарате Erweka Granulate Flow Tester GT фирмы Erweka (Германия), анасыпной объем определяли на аппарате Erweka SVM 101/201 Tapped DensityTester фирмы Erweka (Германия).

Определение проводили в 3 повторностях.2.2.4.2 Разработка способа получения жидкого экстрактаВ качестве базовых схем экстрагирования при разработке способаполучения жидкого экстракта были использованы методики дробноймацерации и дробной мацерации по принципу противотока без упариванияизвлечений и соотношением сырья и экстрагента 1:1 с учетом коэффициентапоглощения. Перколяция по классической схеме.49Дробная мацерация с разделением экстрагента на три части присоотношении сырье: экстрагент.

[6,10,19].Дробная мацерация по принципу противотока с разделением сырья иэкстрагента на три равные части. [11,19].Перколяция с десятикратным избытком экстрагента по отношению ксырью и получением 85% концентрированного извлечения (по отношению ксырью), упариванием разбавленного извлечения до 15% массы готовогопродукта и растворении его в концентрированном. [11,19]2.2.4.3 Методики определения показателей качества жидкогоэкстрактаОпределение содержания спирта этилового в фармацевтическойсубстанции - жидком экстракте травы I.viscosaТаблица 2.5 – Условия хроматографирования спиртаХроматограф:Газовыйхроматограф Agilent7890 с пламенно-ионизационным детектором, расход ПИД: воздуха 300мл/мин, водорода 30 мл/мин;*Колонка:Капиллярная кварцевая колонка DB-624 Agilent, длина30 см, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 1,8мкм (кат.