Диссертация (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 7

Материалы исследования2.1.1 Лекарственное растительное сырьеОбъектами исследований являлись трава I.viscosa (Herba Inulaeviscosae), срезанная на высоте 35-40 см от верха растения, собранная в периоддо начала цветения растения, состоящая из листьев и стеблей, а также побегиI.viscosa, собранные в период цветения, срезанные на высоте 30-35 см от верхарастения, включающие кроме листьев и стеблей еще и цветочные корзинки.Образцы сырья были заготовлены в течение 2014 – 2017 г. г. в Сирии, вокрестностях г. Хомс.Исходные растительные материалы идентифицированы экспертами:• Юсефом Ал-Амори (Yosef AlAmori), профессор отделенияботаники Сирийского международного университета в Дамаске,• Мажидом Молхемом (Majid Molhem), руководитель отделарастительныхпрепаратовфармацевтическойкомпанииLEMPharma,• Рамезом Рустом (Ramez Roustom), профессор, докторфармакологии Университета аль-Баас – Сирия, генеральныйдиректор LEMPharma.38Сертификат анализа – таксономическая идентификация растительногоматериала (Приложение - 1).Собранные побеги I.viscosa для сушки размещали тонким слоем начистойповерхностиподнавесом,периодическиосторожноворошавысушиваемый материал.Образцы сырья помещали в бумажные мешки, которые хранили впроветриваемом помещении при комнатной температуре, не допускаяпопадания на них прямых солнечных лучей ОФС.1.5.1.0001.15 Лекарственноерастительное сырье.

[11]В исследовательской работе использовалось высушенное сырьё HerbaInulae viscosae, измельченное с помощью мельницы аналитической фирмыIKA (модель А11В) до размера частиц, проходящих через сито с отверстиямиразмером 3,0 мм. Сита, использовавшиеся в экспериментах, соответствовалитребованиям ТУ 23.2.2068-89.2.1.2 Вспомогательные вещества и стандартные образцыВсе экстрагенты и реактивы марки «ч» и «хч», производства «Химмед»,Россия (табл.2.1).Таблица 2.1 – Вспомогательные вещества и стандартные образцыНаименование веществаВода очищеннаяХлороформЭтилацетатСпирт этиловый 95%Н-гексанраствор тимолараствор Судана IIIГалловая кислотаКофейная кислотаНДФС.2.2.0020.15НазначениеДисперсионная среда,растворительГОСТ 20015-88ЭкстрагентГОСТ 8981-78ЭкстрагентФС.2.1.0036.15Сорастворитель,экстрагентТУ 6-09-3375-78ЭкстрагентТУ 6-09-3736-79РеагентГОСТ Р 57029- Краситель2016Ph.Eur.

standart Стандартный образецSigmaPh.Eur standart Стандартный образецSigma39Хлорогеновая кислотаPh.Eur standart SigmaРутинPh.Eur standart SigmaБутанол-1ГОСТ 6006-78Кислота уксусная ледянаяГОСТ 61-75Дифенилборилоксиэтиламин EP (Sigma-Aldrich,Германия)ФлороглюцинТУ 6-09-3741-79ДиметилсульфоксидTY 2635-11444493179-08СернаякислотаГОСТ 4204-77концентрированнаяАресполTY 2219-00529053342-97Карбопол ETD 2001USP/NFКарбопол ETD 2020Ph.Eur.Карбопол Ультрез 10Ph.Eur.Карбопол 934USP/NFТрометамолЛСР-001567/08140308, 2008ГлицеринФС.2.2.0006.15Пропиленгликоль (ПГ)Ph.EurПолиэтиленоксид-400ТУ 2483-007(ПЭО-400)711509862006Стандартный образецСтандартный образецРастворительРеагентРеактивРеактивРастворительРеактивСтруктурообразовательСтруктурообразовательСтруктурообразовательСтруктурообразовательСтруктурообразовательНейтрализующий агентСорастворительСорастворительСорастворитель,Реактив2.2.

Методы исследования2.2.1 Идентификация лекарственного растительного сырья I.viscosa2.2.1.1 Макроскопический анализМакроскопический анализ сырья I.viscosa выполняли визуально и спомощью лупы. Размеры определяли с помощью измерительной линейки имиллиметровой ленты используя методику ОФС.1.5.1.0002.15.Изучение диагностических признаков в строении листьев, стеблей ицветковпроводилисогласно(ОФС.1.5.1.0002.15 «Травы»).методике,приведеннойвГФХIII402.2.1.2 Микроскопический анализМикроскопическое исследование органов и тканей растения иполучениемикрофотографийпроводилиспомощьюбиологическогомикроскопа «Ломо Микмед 1» и цифровой камеры Nikon Coolpix A10, снимкидиагностических признаков редактировали в программе «AdobePhotoshopCS5.1».Наличие инулина определяли известным способом с использованиемспиртового раствора тимола и концентрированной серной кислоты [10].

Напредметное стекло наносят 2 - 3 капли раствора тимола, помещают порошоксырья, добавляют каплю серной кислоты и наблюдают появление оранжевокрасного окрашивание смеси.Обнаружение капель эфирного масла под микроскопом проводили вмикропрепаратах тканей растения с раствором Судана III [16]. Для этого напрепаративное стекло наносили спиртовой 2 -3 капли раствора Судана III, вжидкость помещали микропрепарат, накрывали покровным стеклом иосторожно прогревали. Бесцветные капли эфирного масла становились болееконтрастными, окрашиваясь в розовый цвет.2.2.1.3 Определение наличия в сырье некоторых групп БАСВ образцах сырья I.viscosa было определено наличие БАС из следующихгрупп: флавоноиды, сапонины, алкалоиды, дубильные вещества.Фитохимический анализ проводили на извлечениях из измельченногосырья, полученных с помощью разных растворителей.В коническую плоскодонную колбу объемом 250 мл со шлифомпомещали навеску 5,0 г измельченного сырья, добавляли 50 мл водыочищенной.

На кипящей водяной бане нагревали с обратным холодильникомвели нагревание в течение 1 часа. Содержимое колбы фильтровали черезскладчатый бумажный (желтая лента) фильтр. К шроту добавляли 50 мл водыочищенной и проводили экстрагирование еще два раза. Полученныефильтраты объединяли и упаривали до объема 25 мл.41Аналогичным образом, но без нагревания в закрытой емкости и присоотношении сырье/экстрагент 1:10 получали водно-спиртовые извлечения(40%, 70% и 90%).ФлавоноидыВо всех полученных водных и водно-спиртовых извлечениях с помощьюкачественных реакций определяли флавоноиды:- цианидиновая реакция по Брианту: 1 мл водно-спиртовых извлечений+ 2-3 капли соляной кислоты концентрированной + порошок металлическогомагния + 1 мл н-бутанола при встряхивании [47,66,116];- реакция с раствором железа (III) хлорида: 1 мл водно-спиртовыхизвлечений + 1 капля раствора железа (III) хлорида 10% [66];- 1 мл водно-спиртовых извлечений + 5-6 капель спиртового раствораКОН 10% [4,66].Дубильные веществаТанины в водном и водно-спиртовых извлечениях обнаруживали пореакции с раствором желатина 1%, используя по 5 мл каждого компонентареакции, а также раствором железоаммонийных квасцов 1% (1 каплю реагентана 5 мл извлечения) [11].СапониныНаличие сапонинов устанавливали в водных и водно-спиртовыхизвлечениях из образцов сырья на основании результатов следующихкачественных реакций [26]:- пенообразование: в пробирке на 20 мл энергично встряхивали по 3 млизвлечения с 3 мл воды очищенной - в течение 1 мин;- в осадочной пробирке на 5 мл - 1 мл водного извлечения + 3-4 каплираствора ацетата свинца 10 %АлкалоидыНавеску 1,0 г измельченного до 2 мм сырья в плоскодонной коническойколбе со шлифом на 100 мл, заливают 25 мл раствора кислотыхлористоводородной 1% и 30 мин нагревают на водяной кипящей бане при42периодическом помешивании.

Содержимое колбы охлаждают, фильтруютчерез бумажный складчатый фильтр (синяя лента) и проводят качественныереакций с фильтратом [26].Присутствие алкалоидов обнаруживали в водном извлечении из травыI.viscosa с использованием следующих реактивов [26]:- реактив Вагнера-Бушарда: раствор йода в растворе калия йодида;- реактив Драгендорфа: раствор нитрата висмута основного, калияйодида и кислоты уксусной;- реактив Шейблера: раствор кислоты фосфорно-вольфрамовой 1%;- раствор танина 0,1 %;- с серной кислотой концентрированной;- с раствором натрия нитропруссида.2.2.1.4 Числовые показателиДисперсологическую характеристику частиц измельченного сырьяI.viscosa проводили в соответствии с указаниями ОФС.1.1.0015.15 «Ситовойанализ».

При этом использовали набор сит с отверстиями размером от 0,1 до3,0 мм. Определяли массу частиц на каждом сите и на дне с точностью до 0,1г. Пробы измельченного сырья травы I.viscosa массой около 20-30 г помещалив верхнее сито и закрывали крышкой. Набор сит с сырьем помещали навиброустановку «Вибротехник ВП-Т» (Россия) и просеивали механическимспособом в течении 5 мин с последующим определением фракционногосостава.Согласно ОФС.1.5.3.0007.15 определение влажности образцов цельнойиизмельченнойтравыI.viscosaпроведеноспомощьювлагомераинфракрасного (Аквилон АВ-50). [11]Содержание золы общей и золы, нерастворимой в растворе солянойкислоты10%,проведено согласно указаниямОФС.1.2.2.2.0013.15 иОФС.1.5.3.0005.15.Ошибка! Источник ссылки не найден.]43Определениекоэффициентапоглощениясырьемразличныхэкстрагентов проводили согласно требованиям ОФС.1.5.3.0012.15. Навескиизмельченного сырья массой 10,0 г заливают водой очищенной или спиртом40%, илиспиртом 70%, или спиртом 90% в соотношении 1:10.

Посленастаивания в соответствии с ОФС.1.4.1.0018.15 «Настои и отвары» исогласно ОФС.1.4.1.0019.15 «Настойки» извлечения процеживают в мерныйцилиндр, а затем туда же из шрота в перфорированном стакане отжимаютостаток экстрагента, после чего измеряют объем полученного извлечения. [11]В соответствии с требованиями ОФС.1.5.3.0009.15 «Определениесодержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительномсырьеилекарственныхрастительныхпрепаратах»,установлениеконцентраций тяжелых металлов и мышьяка в сырье I.viscosa проводилось сиспользованием метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой- метод 2, на аппарате Agilent 7800 QuadrupoleICP-MS.

[11]Определение концентрации пестицидов (ДДТ и его метаболитов, ГХЦГ(альфа, бета, гамма-изомеры), остающихся в траве I.viscosa (L.), проводилосьв соответствии с ОФС.1.5.3.0011.15 «Определение содержания остаточныхпестицидоввлекарственномрастительномсырьеилекарственныхрастительных препаратах». Анализ методом ГХ/МС проводился на газовомхроматографе Agilent 7890A, производитель Agilent Technologies (США).2.2.2 Методики фитохимического исследования состава БАС в травеI.viscosa2.2.2.1ИсследованиеБАСтравыI.viscosaметодамиУФ-спектрофотометрии и ТСХ.Для изучения были использованы УФ-спектрофотометрия и ТСХ.Концентрированиеизвлеченийизсырьяосуществлялосьудалениемрастворителей на испарителе ротационного типа Heidolph® Laboratory 4002,(Heidolph, Германия).44Спектры извлечений и растворов в УФ- и видимой областях спектраполучали на спектрофотометре Cary WIN UV (Varian, США) в толщинепоглощающего слоя 1 см.В плоскодонной конической колбе на 250 мл со шлифом, около 1,0 гизмельчённого сырья (не более 3 мм) с 50 мл 70 % спирта нагревают собратным холодильником на кипящей водяной бане - 1 час с моментазакипания.