Автореферат (Изучение травы Inula Viscosa (L.) с целью создания экстракта и геля для местного и наружного применения), страница 3

Фрагмент поперечного срезастебля диаметром 3 ммОригинальные фотографии диагностических признаков включены в проект НДInulae viscosae Herba.Проведено изучение БАС целевого фрагмента метаболома травы I.viscosa. Вспектре извлечения (70 % спирт) из травы I.viscosa зарегистрировано два максимумапоглощения при длинах волн около 298 и 329 нм (рисунок 12).Полученный спектр поглощения может служить качественной характеристикойпри установлении подлинности ЛРС I.viscosa.Разработана методика ТСХ в системе н-бутанол - кислота уксусная ледяная – вода(4:1:1) с детекцией зон адсорбции в УФ - свете при длине волны 365 нм до и послеобработки хроматограммы последовательно растворами дифенилборилоксиэтиламина иПЭГ-400 (рисунок 13).

Установлено наличие фенолкарбоновых кислот (хлорогеновой,кофейной и галловой) и флавоноидов - рутина. Предложенная методика ТСХ дляопределения подлинности сырья, экстракта и геля включена в проекты НД.13Рисунок 12. Спектр поглощения извлечения из травы I.viscosaЛиния фронтаRf 0,76Rf 0,76Rf 0,75Rf 0,58Rf 0,75Rf 0,58Rf 0,51Линия стартаАRf 0,51БВРисунок 13. Хроматограмма извлечения (70% спирт)из травы I.viscosa и растворов СО(УФ-свет365нм,детектор–растворыдифенилборилоксиэтиламина и ПЭГ-400):А – извлечение травы I.viscosa;Б – СО галловой кислоты и рутина;В – СО хлорогеновой кислоты;Г – СО кофейной кислоты.ГИзучение состава целевого фрагмента метаболома травы I.viscosa методомУВЭЖХ/МС проводилось в извлечении 70 % спиртом.

Обнаружены 19 полифенольныхкислот (хлорогеновая, кофейная, цинарин и их изомеры), 5 флавононолов (таксифолин,падматин включая их изомеры), 16 флавонолов, флавонов и их гликозидов (непетин,гиспидулин, рамнетин, гиперозид и др. в т.ч. изомеры) и вещества иной природы(инувисколид, томентозин).Определение содержания летучих компонентов методом ГЖХ показало наличие225 пиков, из которых идентифицировано по библиотеке 82 соединения. Выявлено, чтоосновными компонентами БАС I.viscosa, произрастающего в Сирии, являютсятоментозин и его изомер (3,9%) и другие сесквитерпеновые соединения эйдесмановоготипа (1,9%).Содержание эфирного масла в траве I.viscosa, определенное по методу 1 (ОФС1.5.3.0010.15), составляет от 0,22% до 0,47%.14Для разработки проекта НД на Inulaе viscosaе herba определены числовыепоказатели измельченного сырья (таблица 2).Таблица 2.

Числовые показатели измельченной травы I.viscosaЧисловой показательInula viscosa herbaФракционный состав частицизмельченной травыЧастиц на сите с отверстиями Содержание фракции, %:размером: 3 мм0,28±0,0022 мм41,65±0,421 мм32,23±0,820,5 мм15,68±0,060,1 мм8,32±0,08Частиц, прошедших сквозьсито 0,1 мм1,84±0,0432,10±0,345,23±0,310,22±0,40,868±0,02Экстрактивные вещества, %Влажность, %Зола общая, %Зола, не растворимая в 10 %растворе HCl, %Тяжелые металлы и пестицидымг/кг*(нормы поОФС 1.5.3.0009.15,ОФС 1.5.3.0011.15)Микробиологическая чистотакадмий0,035±0,007*1,0ртуть0,014±0,004*0,1свинец0,710±0,002*6,0мышьяк0,002±0,001*0,5ДДТ и его метаболитыменее 0,001*0,1ГХЦГ (α, β, γ изомеры) менее 0,001*0,1Согласно требованиям ОФС 1.2.4.0002.15, категория 4 БПолученные данные включены в проект НД Inulaе viscosaе herba.Результаты изучения БАС целевого низкомолекулярного фрагмента метаболоматравы I.viscosa и оценка их предполагаемой активности in silico, коррелируют с даннымилитературы, что позволяет считать фенольные соединения, в частности, флавоноидыдействующими веществами.Разработана методика определения суммы фенольных соединений в пересчете нахлорогеновую кислоту (рисунок 14).

УФ-спектр разведения извлечения из ЛРС в области280-350 нм совпадает с таковым хлорогеновой кислоты, а в качестве аналитическоговыбран максимум при 328 нм.Содержание суммы фенольных соединений в образцах травы I.viscosa в пересчетена хлорогеновую кислоту составило от 6,87 до 7,63%. Проведена валидацияразработанной методики для стандартизации качества сырья.Детализация состава суммы фенольных соединений методом УВЭЖХ выявиланаличие значительного количества флавоноидов, дающих существенный вклад в15проявление противовоспалительной активности, констатируемой в литературныхисточниках и прогнозируемой in silico.Рисунок 14. УФ-спектры извлечения (70% спиртом) из травы I.viscosa (1) и раствора СОхлорогеновой кислоты (2).При сравнении спектров поглощения раствора комплексов флавоноидов из травыI.viscosa и РСО рутина установлено, что в диапазоне длин волн 404 - 412 нм они имеютсовпадающие максимумы (рисунок 15), это определило выбор длины волны 410 нм вкачестве аналитической.Рисунок 15.

УФ-спектры растворов комплексов флавоноидов с реактивом AlCl3:1) рутин СО; 2) извлечение из травы I.viscosa; 3) извлечение из экстракта I.viscosa; 4)раствор «Жэтривис-гель»16Разработана методика количественного определение суммы флавоноидов в сырьев пересчете на рутин, после реакции с алюминия хлоридом. Содержание суммыфлавоноидов в траве I.viscosa в пересчете на рутин составляет от 1,98 до 2,20%. Методикавалидирована и включена в проект НД.С помощью веб-сервиса PASS сделан прогноз биологической активности,выявленных методом УВЭЖХ, БАС целевого фрагмента метаболома I.viscosa.

Дляхлорогеновой кислоты, инувисколида, падматина, цинарина, гиспидулина и др.спрогнозированы антимикробная, противовоспалительная, репаративная и другие видыактивности, что свидетельствуют о целесообразности разработки жидкого экстракта иаппликационных ЛФ на его основе.3. Разработка способа получения жидкого экстракта из травы I.viscosaЦелесообразность разработки жидкого экстракта 1:1 из травы I.viscosa обусловленавысоким содержанием экстрактивных веществ (30%) и присутствием значительногоколичества летучих компонентов в сырье.Для разработки способа получения жидкого экстракта из травы I.viscosa былиизучены технологические характеристики измельченного сырья, данные представлены втаблице 4.Таблица 4.

Технологические характеристики измельченной травы I.viscosaТехнологическая характеристика растительного материалаЗначенияНасыпной объем, млНасыпная плотность, г/см3Сыпучесть, сКоэффициент поглощения сырья при экстракции 70% спиртом, мл/гЭкстрактивные вещества, %80,0±1,30,35±0,01313,3±0,41,21±0,0432,10±0,34Экспериментально установлено, что размер частиц сырья в диапазоне от 0,2мм до3,0мм не оказывает существенного влияния на выход фенольных соединений, поэтомупри разработке способа получения жидкого экстракта использовали растительныйматериал, измельченный до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиямидиаметром 3мм.Полученные данные необходимы для расчета количества экстрагента и рабочегообъема экстрактора.В качестве экстрагента для получении жидкого экстракта выбран 70% спирт, какнаиболее полно извлекающий БАС целевого фрагмента метаболома I.viscosa. Выбор17методики экстрагирования для получения жидкого экстракта обоснован содержаниемсухого остатка в извлечении (таблица 5).

В качестве базовых схем экстрагирования безупаривания извлечений и соотношением сырья и экстрагента 1:1 с учетом коэффициентапоглощения были апробированы методики дробной мацерации и дробной мацерации попринципу противотока, выход сухого остатка составил 12 % и 16 % соответственно.Таблица 5.

Содержание сухого остатка в жидком экстракте травы I.viscosa, взависимости от методики полученияМетодика получения жидкого экстрактаСодержание сухого остатка, %Дробная мацерация (ремацерация)12,1±0,6Дробная мацерация по принципу противотока16,3±0,2Перколяция20,4±0,5Модифицированная методика30,8±0,3Для достижения показателясухого остатка сопоставимого с содержаниемэкстрактивных веществ в сырье была предложена модификация методики перколяции,представленная на рисунке 16:1.

Этап: 100,0 г измельченного сырья намачивают 100 мл экстрагента 4 часа. Сырьепереносят в перколятор, заливают 1/3 остального экстрагента на 24 часа.2. Этап: сливают первое концентрированное извлечение, в количестве 85% от массысырья. На сырье заливают вторую порцию экстрагента, настаивают 24 часа.3. Этап: сливают второе извлечение из перколятора, сырье отжимают, заливаютоставшийся экстрагент, оставляют на 24 часа.4.

Этап: сливают третье извлечение, сырье отжимают. Объединяют второе и третьеизвлечения, упаривают под вакуумом при 50-600С до 15% от массы взятого сырья.Упаренный остаток растворяют в концентрированном извлечении, отстаивают притемпературе 80С 3 суток.5. Этап: экстракт фильтруют, стандартизуют и фасуют в емкости из темного стекла имаркируют.Разработаннаясхемапредусматриваетсоотношениесырье/экстрагент1:10(установлено экспериментально по выходу флавоноидов и фенольных соединений изсырья), исключает стадию непрерывного тока экстрагента, позволяет получить жидкийэкстракт с содержанием сухого остатка около 30%.