Диссертация (Разработка подходов к стандартизации инновационного лекарственного средства в рамках реализации программы стратегии фарма 2020), страница 11

Таблица 19, 21). Проводили анализ 5стандартных растворов гуанина с концентрациями 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл,10 мкг/мл, 20 мкг/мл. По полученным значениям были построеныкалибровочные графики, приведенные на рисунках совместно с уравнениямикалибровочных кривых.88Рисунок 30.Калибровочный график №1 зависимости площадипика гуанина от концентрации в раствореРисунок 31.Калибровочный график №2 зависимости площадипика гуанина от концентрации в раствореПолученные коэффициент корреляции соответствует нормам (не менее0,99).Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены втаблицах 16 и 17.Таблица 19.

Отклоненияконцентрацийкалибровочныхрастворовфактических значений, калибровочный график №1.Концентрация,фактическая, мкг/млКонцентрация,рассчитанная, мкг/млε, %Норма, неболее %10,98-2,0221,96-1,9255,061,22от891010,010,122019,99-0,12Таблица 20. Отклоненияконцентрацийкалибровочныхрастворовфактических значений, калибровочный график №2.Концентрация,фактическая, мкг/млКонцентрация,рассчитанная, мкг/млε, %Норма, неболее %10,98-2,021,97-1,9255,071,42109,99-0,122020,002от902.7.5.6Правильность и прецизионностьПроводилианализ3образцовстандартныхрастворовгуанинасконцентрациями 20 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2 мкг/мл.

Анализ проводили дляпоследовательностипо5вколовдлякаждогоуровняконцентраций.Прецизионность оценивали как повторяемость (сходимость) и промежуточнуюпрецизионность. Анализ проводили для двух последовательностей по 5 вколовдля каждого уровня концентраций. Для полученных значений концентрацийбыли рассчитаны величины относительного стандартного отклонения (RSD, %)и относительной погрешности (ε, %), приведенные в таблицах:Таблица 21.Правильность и прецизионность методики (внутрицикла)введено(мкг/мл)найдено(мкг/мл) посл.1найдено (мкг/мл),среднее значение(n=5)S.D.(n=5)RSD, %(n=5)ε, %2,010,031,300,304,960,040,83-0,8720,210,190,931,062,032,0322,011,971,994,955,0254,984,904,9320,3220,282020,1420,4019,9291Таблица 22.Правильность и прецизионность методики (междуциклов)введенонайдено(мкг/мл)(мкг/мл) посл.2найдено (мкг/мл),S.D.RSD, %(n=10)(n=10)2,010,031,300,404,040,061,470,0020,180,170,820,98среднее значение(n=10)ε, %2,021,9721,992,042,034,084,0643,944,044,0619,9820,102020,3820,3020,14Для расчета относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %) на уровне между циклов использовалисьданные (n=10), полученные в течение 1-ой последовательности (внутри цикла)и 2-ой последовательности (между циклов).Полученныевеличиныотносительногостандартногоотклонения(прецизионность) и относительной погрешности (правильность) соответствуютнормам (не более 2%).2.7.6ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием прианализе ациклогермания.92Врезультатемасс-спектрометрическогоисследованияобразцовациклогермания был определен наиболее интенсивный mrm-переход дляопределяемой примеси, 152.1>110.0, что согласно литературным данным,является наиболее характерным значением для гуанина [107].

Было проведеноисследование стандартного образца гуанина, а также образца ациклогерманияпри хроматографических условиях, аналогичных методу ВЭЖХ с массспектрометрическимдетектированием дляколичественногоопределенияацикловира (пункт 2.4.3). Растворы были приготовлены в соответствии сметодикой, описанной в пункте 2.4.5.Метод показал высокую чувствительность и селективность, что позволяетпотенциально использовать его в качестве альтернативного методаколичественной оценки содержания примеси гуанина в субстанции илекарственных формах ациклогермания.93Рисунок 32.Хроматограммастандартногорастворагуанинасконцентрацией 2 мкг/мл (МС-детектирование).2.8 Применение химических реакций для определения подлинностиациклогермания.С целью подтверждения наличия в составе субстанции ациклогерманияфрагментааргининакачественныхихимическихцитрат-ионареакций.былопредложеноИспользованиеболееиспользованиесложныхидорогостоящих инструментальных методов было признано нецелесообразнымпо причине вспомогательного характера аргинина и цитрат-иона в изучаемомкомплексном соединении.Реакция аргинина с -нафтолом в присутствии окислителя (реакцияСакагучи) была открыта в 1925 году и впоследствии включена в огромноечисло нормативных документов, в том числе ГФ 10.

Аналитическимрезультатом реакции является появление интенсивного красно-оранжевого94окрашивания.РеакцияСакагучиявляетсявзначительнойстепениспецифичной, так как для других образующиеся в результате схожих реакцийсоединений (различных производных нафтохинона, в которых водородаминогруппы замещен на алкильный или арильный радикал) характернымявляется желтое окрашивание. Реакция Сакагучи может быть использована втом числе и для количественной оценки содержания аргинина, в определенномдиапазоне концентраций достоверно коррелируя с данными ВЭЖХ-анализа.Методика реакции приведена в Приложении («Нормативная документация длясубстанции ациклогермания).ВозможныймеханизмреакцииСакагучиприведеннарисунке:Рисунок 33.Механизм реакции СакагучиБыла произведена оценка специфичности методики.

Три независимыхобразца субстанции ациклогермания при анализе при помощи данной методикипоказали образование красно-оранжевого осадка. При параллельном анализемодельной смеси, состоящей из ацикловира, германия диоксида и лимоннойкислоты в соотношении 1 : 1 : 2, раствор оставался бесцветным.В качестве качественной реакции для обнаружения цитрат-иона былапредложена реакция осаждения хлоридом кальция, являющаяся традиционнойдля данного соединения. Аналитическим результатом реакции является95образование белого осадка, которое происходит при кипячении раствора, таккак при комнатной температуре цитрат кальция растворим в воде.

В проектнормативной документации включена методика, основанная на ГФ XI (глава«Общие реакции на подлинность», раздел «Цитраты»). Методика реакцииприведена в Приложении («Нормативная документация для субстанцииациклогермания).Механизмреакциипредставленнарисунке:Рисунок 34.Механизм реакции хлорида кальция с цитрат-иономБыла произведена оценка специфичности методики. Три независимыхобразца субстанции ациклогермания при анализе при помощи данной методикипоказали выпадение осадка при кипячении. При параллельном анализемодельной смеси, состоящей из ацикловира, германия диоксида и аргинина всоотношении 1 : 1 : 1, раствор оставался бесцветным.962.9Выводы к Главе 2.Произведено определение физических и физико-химических свойствсубстанции ациклогермания, определение ее ИК-, ААС-, УФ-, а также массспектров ее компонентов, ее хроматографической подвижности.

Произведеныисследования, позволяющие произвести разработку проекта нормативнойдокументации для фармацевтической субстанции ациклогермания.97ГЛАВА 3. УСТАНОВЛЕНИЕ НОРМ КАЧЕСТВА ЛАБОРАТОРНЫХОБРАЗЦОВ СУБСТАНЦИИ АЦИКЛОГЕРМАНИЯУстановление норм качества лабораторных образцов ациклогерманияпроизводилось с целью валидации технологии получения субстанции иразработки проекта нормативной документации.Качествоследующимлабораторныхпоказателям:образцоввнешнийациклогерманиявид,оценивалосьрастворимость,попрозрачность,цветность, pH водного раствора, неидентифицированные примеси, содержаниепримеси гуанина, количественное содержание германия, количественноесодержание ацикловира.Анализ производили по разработанным методикам (см.

Приложение 1). Наосновании полученных данных был подготовлен проект нормативнойдокументации для субстанции ациклогермания (Приложение 1).Таблица 23.Переченьизученныхобразцовсубстанцииациклогермания.Содержаниеосновнойпримеси(гуанина)относительноацикловира,%)Содержаниеосновнойпримеси(гуанина),%Дата началаанализа№Код образцасубстанцииСодержаниеацикловира,%1WDS -1 (1)9,6NANA6.10.142WDS -1 (2)10,1NANA6.10.143WDS -1 (1)9,7NANA6.10.144WDS-1 от 07.04№117,042,090,4827.04.155WDS-1 от 07.04№216,092,870,6527.04.156WDS-1 от 07.04№316,251,750,4027.04.157WDS-1 от 07.04№416,923,940,9027.04.15981,948WDS-1(роторнаясушка)13,918,529ИВ-2201,440,12NA12.12.1410ИВ-2212,150,11NA12.12.1411ИВ-2231,340,18NA12.12.14Таблица 24.Переченьизученных27.04.15образцовпромежуточныхпродуктов синтеза ациклогермания№КодированиеСодержаниеосновнойпримеси(гуанина)относительноацикловира, %1ИВ-30110023,8116.10.152ИВ-3021,710,4116.10.153ИВ-3031,510,3616.10.154ИВ-3043,680,8816.10.155ИВ-3050,830,2016.10.156ИВ-280 (1%)27,056,4418.06.157ИВ-277(1%)23,215,5318.06.158ИВ-277(0,5%)8,792,0918.06.159ИВ-277 (3,5%,порошок)9,102,0818.06.1510ИВ-282(2%)41,519,4818.06.1511ИВ-281(1,3%)22,905,2318.06.1512ИВ278(0,85%)16,943,8718.06.1513ИВ278(3,5%,порошок)83,6219,7918.06.1514ИВ-278 (3,5% рр WDS на 0,55ACV)13,640,0018.06.1515ИВ290(0,9%)1,063,2306.07.151,260,0006.07.1516ИВ-Содержаниеосновнойпримеси(гуанина), %Дата анализа99289(0,9%)1718ИВ-286(1%)ИВ220/2(1,2%)1,770,2506.07.151,090,3006.07.1519ИВ-291(1%)4,400,4206.07.1520ИВ-2930,940,2606.07.1521ИВ-298A4,791,0402.09.1522ИВ-298B3,1523ИВ-298С1,4324ИВ-299А2,5425ИВ-299B1,320,2202.09.151,1302.09.150,7502.09.150,3402.09.15Нормативные требования к фармацевтической субстанции, разработанные врезультате анализа лабораторных образцов, приведены в таблице:100Таблица 25.Нормы качества лабораторных образцов субстанцииациклогерманияПоказательНормаОписаниеБелый или почти белыйкристаллический порошок беззапахаПодлинностьИнфракрасный спектрсубстанции, снятый в области от4000 до650 см-1 по положениюполос поглощения долженсоответствовать прилагаемомурисунку спектра стандартногообразцаВремя удерживания основногопика на хроматограммеиспытуемого раствора должносоответствовать времениудерживания основного пика нахроматограмме стандартногораствораПри проведении реакции Сакагучидолжно образовыватьсяустойчивое оранжево-красноеокрашиваниеПри реакции с хлоридом кальциядолжен образовываться белыйосадок при кипячении раствораРастворимостьСубстанция должна быть оченьлегко растворима в водеочищеннойПрозрачностьраствораРаствор субстанции в водеочищенной должен бытьпрозрачным или выдерживатьсравнение с эталоном IЦветность раствораРаствор субстанции в водеочищенной должен бытьбесцветным или выдерживатьсравнение с эталоном Y7pHpH составляет от 2,0 до 2,5 (1%водный раствор)ПосторонниепримесиЕдиничнойнеидентифицированной примеси101должно быть не более 0,5%.Суммы примесей должно быть неболее 1%.

Содержание гуанина всубстанции ациклогерманиядолжно составлять не более 0,5 %.Количественноеопределение:Содержание германия всубстанции должно быть впределах от 10,0 % до 12,5%Содержание ацикловира всубстанции должно быть впределах от 16,0 % до 19,0 %Выводы к Главе 3.1. Изучены физико-химические свойства и спектральные характеристикилабораторных образцов ациклогермания.2. Определено количественное содержание компонентов основноговещества и примесей в субстанции ациклогермания.3.

Установлены нормы качества для проекта нормативной документациидля субстанции ациклогермания.4. Подготовлен проект нормативной документации для субстанцииациклогермания.102ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИРАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫАЦИКЛОГЕРМАНИЯ (ГЕЛЬ).4.1 Объекты и методы исследованияОбъектами исследования являлись образцы геля ациклогермания 3%, ООО«ВДС Фарма». Объект представлял собой бесцветный либо желтоватый гель смятным запахом [22].Таблица 26.Компоненты лекарственной формы ациклогермания(гель)№НаименованиеЗначение1Вода очищеннаярастворитель2Пропиленгликольгелеобразователь [31]3Ациклогерманийдействующее вещество4Гидроксиэтилцеллюлозагелеобразователь5Натрия альгинатгелеобразователь [5]6Полисорбатсолюбилизатор7МетилпарабенконсервантКсилитолкоррегент вкуса [25, 26]Ментолароматизатор8103Таблица 27.Перечень изученных образцов лекарственной формыациклогермания.№Код сериипрепаратаСодержаниеацикловира(%)Содержаниеосновнойпримеси(гуанина)относительноацикловира, %1WDS-1 гель 3%01140,490,1124.10.142WDS-1 гель 3%09140,470,0524.10.143WDS-1 гель 3%(0915)0,480,116.10.154WDS-1 гель(07.04)0,430,427.04.155WDS-1 гель(1214)0,40,9815.01.156WDS-1 гель(1013)0,0051295615.01.15Дата началаанализа4.2 Модификация методов качественного и количественного анализаациклогермания для анализа лекарственной формыЛегкаяводорастворимостьгеляациклогермания,какосновногодействующего вещества, так и вспомогательных компонентов лекарственнойформы, позволяет использовать для его анализа методы контроля качества дляфармацевтическойсубстанциисминимальнымимодификациями.Дляколичественного определения и определения содержания примесей былпредложен метод пробоподготовки, заключающийся в растворении навесокгеля в воде с последующим фильтрованием.