Диссертация (Разработка подходов к стандартизации инновационного лекарственного средства в рамках реализации программы стратегии фарма 2020), страница 10

Сделано заключение о целесообразностивключения методики в проект нормативной документации.2.7.3.2РастворыПриготовлениестандартныхрастворованалогичноприготовлениюстандартных растворов для методики ВЭЖХ с УФ-детектированием (пункт2.7.2.2).Приготовление элюента В подвижной фазы: 10 мМ водного раствораформиата аммония. В мерную колбу вместимостью 1 литр помещали 0,63 гформиата аммония и растворяли в 500 мл воды Milli-Q.

Далее доводилиобъем тем же растворителем до метки и перемешивали.Компонент Б подвижной фазы – ацетонитрил для хроматографии.2.7.3.3Хроматографические условияКолонкаPerfectsil MZ-micro2 C8 5x100x2.1Температура колонки25 ºСПодвижная фазаКомпонент А и Компонент Б в соотношении 30:70Скорость потока400 мкл/минДетекторПозитивная ионизация(MRM(E+)), m/z 226,1>152,1Объем пробы4 мклВремя анализа3 мин76Хроматограмма стандартного раствора ацикловира (10 мкг/мл) приведенана рисунке:Рисунок 22.Хроматограмма стандартного раствора ацикловира сконцентрацией 10 мкг/мл (МС-детектирование).2.7.3.4Правильность и прецизионностьПроводили анализ 3 образцов стандартных растворов ацикловира сконцентрациями 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл.

Анализ проводили для 2последовательностей по 5 вколов для каждого уровня концентраций.Исследование проводили в течение 1-ой последовательности (внутри цикла)и 2-ой последовательности (между циклов). Прецизионность оценивали какповторяемость (сходимость). Для полученных значений концентраций былирассчитаны величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %), приведенные в Таблицах.77Таблица 17.Правильность и прецизионность методики (внутрицикла)введено(мкг/мл)найдено(мкг/мл) посл.1найдено (мкг/мл),среднее значение (n=5)S.D.(n=5)RSD, %(n=5)ε, %10,920,867,849,2453,031,242,346,07102,971,981,922,9711,879,601010,7610,9611,4353,4052,605054,1353,9551,09102,42106,23100100,95102,16103,1178Таблица 18.Правильность и прецизионность методики (междуциклов)введено(мкг/мл)найдено(мкг/мл) посл.2найдено (мкг/мл),среднее значение(n=10)S.D.(n=10)RSD, %(n=10)ε, %10,630,746,986,3052,972,073,915,94102,711,521,482,7111,1510,21109,8310,579,9252,4153,955049,851,1957,2101,38101,96100104,16102,34102,38Для расчета относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %) на уровне между циклов использовалисьданные (n=10), полученные в течение 1-ой последовательности (внутри цикла)и 2-ой последовательности (между циклов).792.7.3.5ЗаключениеПреимуществамиразработаннойспектрометрическимдетектированиемметодиковс(ВЭЖХметодикипоВЭЖХсравнениюУФ-детектированием)сявляетсясмасс-альтернативнойпростота,низкаятрудоемкость и сниженное время анализа, однако, низкие значения точности ипрецизионности методики, не укладывающиеся в требования о не более чем 2%отклонении, не позволяют рассматривать ее в качестве основной.2.7.4Идентификация основной примеси ациклогерманияПри проведениихроматографического анализа образцов субстанцииациклогермания было установлено наличие характерного пика примеси свременем удерживания около 3 минут, время удерживания относительно пикаацикловира около 0.75.

Спектр поглощения пика примеси, снятый при помощиприменяемого для хроматографического анализа УФ-детектера, в значительнойстепени совпадал с соответствующим спектром ацикловира. Возникланеобходимость идентификацииданнойпримесисцельюопределениядопустимости ее содержания (путем установления по литературным даннымкласса опасности для данного вещества), а также для выдвижения гипотезыотносительновозможныхпричинпоявленияпримесииспособовихустранения.С целью первичной идентификации примеси был предложен метод хроматомасс-спектрометрии. Для этого опыт исследования образца субстанцииациклогермания был в точности воспроизведен на жидкостном хроматографе,снабженном УФ-детектором, а также масс-селективным детектором с тройнымквадруполем.

В результате были получены хроматограммы образца, снятые припомощи УФ-детектора, на которых наблюдались характерные пики ацикловираиосновнойпримеси,атакжепроизведеномасс-спектрометрическоесканирование по диапазону масс от 100 до 1000. Во временной точке,соответствующей на хроматограмме пику основной примеси, на масс-спектре80был обнаружен характеристический ион с отношением m/z около 152. Врезультате анализа литературных данных было выдвинуто предположение, чтоданный ион соответствует гуанину (рис.

1-2). Гуанин (2-амино-1H-пурин-6(9H)он), молярная масса 151,13 г/моль, является одной из примесей, характернойдля ацикловира, продуктом его термического разложения. Европейскаяфармакопея 8 издания определяет его как допустимую идентифицированнуюпримесь (примесь B).Рисунок 23.Возможная схема ионизации гуанина.81Рисунок 24.точке,Масс-спектр субстанции ациклогермания во временнойсоответствующейпикуосновнойпримеси(полноесканирование, вычитание фона не производилось).С целью проверки и подтверждения произведенной идентификации примесибыло проведено УФ-спектрометрическое исследование образца стандартнойсубстанции гуанина. Около 0,01 г субстанции гуанина (точная навеска)растворяли в 100 мл воды очищенной, подкисленной ортофосфорной кислотойдо значения pH 2.0.

Данное значение pH соответствует показателю pH для 1%растворасубстанцииациклогермания.Хроматографировалиполученныйраствор согласно методике хроматографического анализа ациклогермания.В результате проведенного исследования было установлено, что времяудерживания пика гуанина в данных условиях близко к времени удерживанияпика основной примеси на хроматограмме образца ациклогермания, форма ихспектров поглощения в УФ-области также совпадает.Рисунок 25.Оптический спектр основного пика на хроматограмместандартного образца ацикловира.82Рисунок 26.Оптический спектр основного пика на хроматограммеобразца ациклогермания.Рисунок 27.Оптический спектр основного пика на хроматограмместандартного образца гуанина.83Рисунок 28.Оптическийспектрпикахроматограмме образца ациклогермания.основнойпримесина84Рисунок 29.Хроматограмма стандартного раствора гуанинаНа основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, чтоосновная примесь, имеющая на хроматограммах образцов ациклогермания(относительное время удерживания по ацикловиру около 0,75 и абсолютноеоколо 3 минуты), с высокой вероятностью может являться гуанином, или жекрайне близким к нему соединением [3] (Алешин С.В Разработка методикиопределения фрагмента ацикловира в составе инновационного лекарственногопрепаратаациклогерманий методомВЭЖХ.

Идентификация основнойпримеси / С.В. Алешин [и др.] // Сорбционные И ХроматографическиеПроцессы. – 2016. – № 1(16). – С. 93–99).852.7.5Валидация методики количественного определения гуанина всубстанции ациклогермания методом ВЭЖХ с УФ-детектированием2.7.5.1РезюмеБыла проведена валидация методики количественного определения гуанинавфармацевтическойсубстанции,прихроматографическихусловиях,аналогичных условиям ранее разработанной и валидированной методикиопределения ацикловира. Методика была валидирована по следующимвалидационнымопределения,параметрам:аналитическаяспецифичность,область,пределлинейность,количественногоправильность,прецизионность. Использование в качестве растворителя для стандартногообразца гуанина подвижной фазы, а не воды очищенной, обусловлено физикохимическими свойствами вещества (крайне низкой растворимостью в воднойсреде с нейтральным значением pH).Подтвержденный аналитическийдиапазон методики составил 2 мкг/мл – 20 мкг/мл в водном растворе.Полученные данные подтверждают пригодность методики для количественнойоценке содержания гуанина в составе ациклогермания.2.7.5.2РастворыПриготовление исходного стандартного раствора (200 мкг/мл).Для приготовления исходного стандартного раствора гуанина 20 мгстандартногообразца(точнаянавеска)помещаливмернуюколбувместимостью 100 мл, доводили до метки подвижной фазой, тщательноперемешивали до полного растворения образца.

Конечная концентрацияраствора составила 200 мкг/мл гуанина.3. Приготовление растворов стандартов.Конечная концентрация растворов гуанина составила:20 мкг/мл (1 мл стандартного раствора с концентрацией 200 мкг/млпомещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки подвижнойфазой, тщательно перемешивали)8610 мкг/мл (5 мл стандартного раствора с концентрацией 20 мкг/мл помещалив мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки подвижной фазой,тщательно перемешивали);5 мкг/мл (2,5 мл стандартного раствора с концентрацией 20 мкг/млпомещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки подвижнойфазой, тщательно перемешивали);2 мкг/мл (1 мл стандартного раствора с концентрацией 20 мкг/мл помещалив мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки подвижной фазой,тщательно перемешивали)1 мкг/мл (0,5 мл стандартного раствора с концентрацией 20 мкг/млпомещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до меткиподвижной фазой, тщательно перемешивали).Проводили анализ стандартного раствора гуанина с концентрацией 20мкг/мл, растворителя, раствора образца ациклогермания.

На хроматограммерастворителя отсутствовали пики с временем удерживания гуанина.2.7.5.3СпецифичностьБыло проведено исследование Модельной смеси 1, представляющей собойсмесь лимонной кислоты, аргинина, ацикловира, германия диоксида и гуанинав соотношении 4 / 1 / 1 / 1 / 0,1 (по массе), Модельной смеси 2 представляющейсобой смесь лимонной кислоты, аргинина, германия диоксида в соотношении 4/ 1 / 1 (по массе), образца ациклогермания, содержащего значительноеколичество примеси гуанина (Образец WDS-1 от 07.04 №4, см. Таблицу 19).Времена удерживания пиков ацикловира и гуанина на хроматограммахМодельной смеси 1 и ациклогермания совпадали.

На хроматограммеМодельной смеси 2 сигнал отсутствовал. Коэфициент разрешения пиковацикловира и ациклогермания, расчитанный по Формуле 4, составил 3,16.2.7.5.4Предел количественного определения87Пределколичественногоопределенияметодикибылоцененпосоотношению сигнал/шум. Было произведено исследование стандартныхрастворов гуанина с концентрациями 1 мкг/мл и 2 мкг/мл.Минимальная концентрация гуанина в образце, при которой величинаотношения аналитического сигнала к уровню шума составляет около 10:1 былаопределена как 1 мкг/мл.2.7.5.5Аналитическая область и линейностьАналитическая область методики составила 1 мкг/мл – 20 мкг/мл в водномрастворе, что соответствует содержанию гуанина 0,1 – 2% в субстанцииациклогермания (предельно допустимое содержание гуанина в субстанцииациклогермания, определенное в результате изучения технических образцовсубстанции, составляет 0,5%, см.