Автореферат (Разработка подходов к стандартизации инновационного лекарственного средства в рамках реализации программы стратегии фарма 2020), страница 3

Для фармакопейной методикибыло предложено использовать построение калибровочного графика по тремточкам, используя диапазон концентраций стандартного раствора, обладающийнаибольшей линейностью, 1, 5 и 10 мкг/мл. Исходя из полученных данных, атакже информации о строении комплексной молекулы ациклогермания,предложены методики приготовления стандартных и испытуемых растворов, атакже расчетная формула содержания германия.ВЭЖХ при анализе ациклогерманияВ качестве основного метода качественного и количественного определенияфрагмента ацикловира в составе субстанции ациклогермания было предложеноиспользованиеВЭЖХсУФ-детектом.В результате исследования образца ациклогермания в соответствии с взятой за15основу методикой из Европейской фармакопеи 8.0 была обнаружена еенедостаточная пригодность для переноса в проект НД для ациклогермания безизменений, так как: время удерживания ацикловира на хроматограмме образцаациклогермания и на хроматограмме стандартного раствора ацикловиразначительно различалось, а также коэффициент разрешения, рассчитанный дляпиков основного вещества и основной примеси на хроматограмме образцаациклогермания составлял менее 1.Данный результат предположительно может быть следствием значительнойразницызначенийpHводныхрастворовацикловира,проявляющегослабощелочные свойства, и ациклогермания, дающего кислотные значения pH.Для подтверждения данного предположения было произведено исследованиеобразца ацикловира, разведенного раствором ортофосфорной кислоты (pH 2,1)в соотношении 1 к 10.

Время удерживания пика основного вещества нахроматограмме данного образца соответствовало времени удерживания нахроматограмме ациклогермания.Таким образом, одним из главных критериев разрабатываемой ВЭЖХметодики качественного и количественного определения фрагмента ацикловиравсоставеациклогерманияявлялосьдостижениевысокогопоказателяустойчивости к изменению pH в данном диапазоне. Другим важным критериемявлялось достижение пригодности разрабатываемой методики без измененияхроматографических условий для оценки примесей (коэффициент разрешениядля пиков основного вещества и основной примеси должен быть более 1).Кроме того, важным критерием являлось достижение максимальной простоты ивоспроизводимости методики.

Нормы количественного содержания ацикловирав составе ациклогермания были рассчитаны исходя из информации о структурекомплексной молекулы.16Таблица 3. Хроматографические условияКолонкаС18, 250 мм х 4,6 мм, 5 мкмТемпература колонки25 ºСПодвижная фазаКомпонент А (фосфатный буферный раствор с pH 2,5) и КомпонентБ (ацетонитрил для ВЭЖХ) в соотношении 94:6Скорость потока1 мл/минДетекторУФ-детектор, длина волны 254± 4 нмОбъем пробы10 мклВремя анализа10 минРисунок 2. Хроматограмма образца ациклогермания, снятая в соответствии сразработанной методикой (образец ИВ-289, присутствуют пики примесей)Валидация методики количественного определения фрагмента ацикловира всоставе ациклогермания методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.Была проведена валидация разработанной методики количественногоопределения ацикловира в фармацевтической субстанции.17Таблица 4. Основные валидационные характеристикиВалидационнаяхарактеристикаСпецифичностьАналитическаяобласть(линейность)КонцентрацияобразцаРезультатКритерийприемлемостиВывод осоответствии1 – растворплацебо2 – 100 мкг/млНа хроматограммерастворителя ираствора плацебоотсутствовали пики свременем удерживанияацикловираНа хроматограммеплацебо должно бытьпиков со временемудерживанияисследуемого ЛВСоответствуетКоэффициентыкорреляции r>0,9999, r>0,9989.Относительнаяпогрешностьизмерений составила неболее 1,4%Коэффициенткорреляцииr> 0,999.

Относительнаяпогрешность измеренийдолжна составлять неболее 2%СоответствуетRSD при использованииколонок разныхпроизводителейсоставило 0,76% , RSDпри значениях pHкомпонента Аподвижной фазы вдиапазоне 2.4-2.6составило 1,83%RSD при использованииколонок разныхпроизводителей должносоставлять не более 2% ,RSD при значениях pHкомпонента А подвижнойфазы в диапазоне 2.4-2.6должно составлять неболее 2%СоответствуетОтносительнаяпогрешностьопределений составила-0,72%, 0,88%, -1%соответственно.Относительнаяпогрешностьопределений должнасоставлять не более 2%СоответствуетОтносительноестандартноеотклонение составило0,61%, 0,44%, 0,42%,соответственно.Относительноестандартное отклонениеопределений должносоставлять не более 2%уровней.Соответствует10 мкг/мл25 мкг/мл50 мкг/мл75 мкг/мл100 мкг/млРобастность100 мкг/млПравильность(внутри цикла,intra-day)10 мкг/мл50 мкг/мл100 мкг/млПрецизионность(внутри цикла,intra-day,мемантин)10 мкг/мл50 мкг/мл100 мкг/млИдентификация основной примеси ациклогермания.Глава 2 содержит описание процесса идентификации и нормированиясодержания основной примеси субстанции ациклогермания.

При проведениихроматографического анализа образцов субстанции ациклогермания былоустановлено наличие характерного пика примеси с временем удерживанияоколо 3 минут, время удерживания относительно пика ацикловира около 0.75.Спектр поглощения пика примеси, снятый при помощи применяемого для18хроматографического анализа УФ-детектера, в значительной степени совпадалс соответствующим спектром ацикловира.

На основании проведенныхисследований был сделан вывод о том, что основная примесь, имеющая нахроматограммах образцов ациклогермания (относительное время удерживанияпо ацикловиру около 0,75 и абсолютное около 3 минуты), с высокойвероятностью может являться гуанином. С целью проверки и подтвержденияпроизведеннойидентификациипримесибылопроведеноУФ-спектрометрическое исследование образца стандартной субстанции гуанина.В результате проведенного исследования было установлено, что времяудерживания пика гуанина в условиях методики близко к времени удерживанияпика основной примеси на хроматограмме образца ациклогермания, форма ихспектров поглощения в УФ-области также совпадают.Рисунок 3.Оптический спектр основного пика наобразца гуанинахроматограмме стандартного19Рисунок 4.Оптический спектр пика основной примеси на хроматограмме образцаациклогермания.Валидация методики количественного определения гуанина в субстанцииациклогермания методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.

Глава 2 содержитописание процесса разработки и валидации ВЭЖХ_методики определениягуанина как идентифицированной примеси в субстанции ациклогермания.Методика была валидирована по следующим валидационным параметрам:специфичность, предел количественного определения, аналитическая область,линейность, правильность, прецизионность.Применениехимическихреакцийдляопределенияподлинностиациклогермания.С целью подтверждения наличия в составе субстанции ациклогерманияфрагмента аргинина была предложена реакция аргинина с -нафтолом вприсутствии окислителя (реакция Сакагучи).

В качестве качественной реакциидля обнаружения цитрат-иона была предложена реакция осаждения хлоридомкальция, являющаяся традиционной для данного соединения. В Главе 2приводится описание методик предложенных химических редакций ирезультаты их валидации.Глава 3 диссертации посвящена установлению норм качества лабораторныхобразцов субстанции ациклогермания с использованием разработанных ранее20методик. На основании полученных данных был подготовлен проектнормативной документации для субстанции ациклогермания, приведенный вПриложении 1 к диссертационной работе.Глава 4 диссертации посвящена изучению физико-химических свойств иразработке методов анализа лекарственной формы ациклогермания (гельводорастворимый 3%). Глава содержит описание модификаций разработанныхранее методик качественного и количественного анализа ациклогермания дляанализалекарственнойациклогермания,какформы.основногоЛегкаяводорастворимостьдействующеговещества,гелятакивспомогательных компонентов лекарственной формы, позволяет использоватьдля его анализа методы контроля качества для фармацевтической субстанции сминимальнымимодификациями.Дляколичественногоопределенияиопределения содержания примесей был предложен метод пробоподготовки,заключающийся в растворении навесок геля в воде с последующимфильтрованием.НавескимодифицированныхациклогерманияобразцаметодикприведеныгеляконтролявбралисьпокачествадляПриложении2массе.(ПроектанализаТекстыгелянормативнойдокументации для лекарственной формы).

Кроме того, глава содержитописание процесса установления срока хранения лекарственной формыациклогермания методом ускоренного старения. В результате проведенияпроцедуры ускоренного старения препарат показал критические несоответствиятребованиям НД, а именно, недопустимое увеличение содержания основнойпримеси на контрольной точке, соответствующей полутора годам хранения(136 дней), после чего эксперимент был досрочно прекращен. Был сделанвывод о возможном разложении части основного вещества (фрагментаацикловира) с образованием основной примеси. Для установления точныхсроковгодностипрепаратанеобходимыдальнейшиестабильности при хранении при комнатной температуре.исследованияТаблица 5.

Исследование стабильности геля ациклогермания, серия 0915.Показатели качестваОписаниеВ началеэкспериментаСроки экспериментального хранения,соответствующие хранению вестественных условиях, мес.61218243036Желтоватый гель с мятным запахомСоответствует–––N/AN/AN/AВЭЖХ. Единичной неидентифицированной примесидолжно быть не более 0,5%.Соответствует,не более 0,1%–––N/AN/AN/AВЭЖХ.

Содержание гуанина должно составлять неболее 0,5 %.Соответствует,0,1%2,9%N/AN/AN/AГерманий: Атомно-абсорбционная спектрометрия.Содержание германия в геле должно быть в пределахот 0,3% до 0,37%.Соответствует,0,34%–N/AN/AN/AАцикловир: ВЭЖХ. Содержание ацикловира в геледолжно быть в пределах от 0,47% до 0,57%Соответствует,0,48%N/AN/AN/AПосторонниепримеси0,15% 0,31%––Количественноеопределение0,48% 0,48% 0,47%ВЫВОДЫ1. В рамках проведенного исследования изучены физико-химическиесвойства субстанции ациклогермания, используемой для производства мягкойлекарственной формы, геля (растворимость, прозрачность, цветность, pHводного раствора). В проект нормативной документации включено испытаниерастворимости с использованием одного растворителя, воды очищенной.Установлено,чторастворсубстанцииациклогермания,изученныйвсоответствии с требованиями ГФ XIII, является прозрачным и бесцветным.Такжебылоустановлено,чтозначениеpH1%водногораствораациклогермания достоверно укладывается в диапазон от 2,0 до 2,2.2.