Диссертация (Изучение высвобождения лекарственных веществ в биорелевантных средах), страница 13

Робастность.Для проверки робастности методики определяли стабильность стандартного раствора мелоксикама, приготовленного для количественного определения мелоксикама.Хроматографировали свежеприготовленные растворы и после храненияв стеклянной колбе, в защищенном от света месте в течение 24 часов притемпературе не выше 25°С.Стабильность растворов оценивали путем сравнения площадей пиковмелоксикама после хроматографирования свежеприготовленных растворов и111растворов после хранения.

Площадь пика мелоксикама в свежеприготовленном растворе принимали за 100 %. Определяли относительное отклонениеплощади пика (в %) мелоксикама от площади, принятой за 100 %.Если отличие Zi от 100 % не превышает 5 %, то раствор считается стабильным в течение испытуемого срока, при невыполнении условия срокихранения растворов сокращаются до срока, в течение которого стабильностьсохраняется.Результаты представлены в таблице 48.Таблица 48Стабильность стандартного раствора мелоксикамаКонцентрацияКонцентра- Срок Площадь пика меанализируеZi,%локсикамация раствохра|Zi мого раство- (Zi=Yi/Xра, мг/млнения,100%|Среднеера, мг/млi*100%)n=3(введено, Xi) сутокзначение (найдено, Yi)117439117422,0011748316,00100,00% 0,00%0117344117235117354,0111744315,9999,94% 0,06%0117384116344116155,6211591715,8398,92% 1,08%711620616,00115439115396,6311548415,7298,28% 1,72%7115267114062113954,3511384715,5397,05% 2,95%3113954112985112833,0711273315,3796,09% 3,91%01127813.5.7.

Валидационные характеристики1121. На хроматограммах биорелевантной среды FaSSIF и модельнойсмеси-плацебо отсутствуют пики, по времени удерживания совпадающие с действующим веществом, что является подтверждением специфичности разработанной методики.2. Полученные значения детектируемых действующих веществ соответствовали нормам, что, в свою очередь, подтверждает правильность валидируемой методики.3. Линейность разработанной методики в диапазоне содержаниядействующего вещества в диапазоне 20% - 110% от заявленногосодержания подтверждена путем анализа модельных смесей свышеуказанным содержанием действующего вещества и последующим построением калибровочной кривой. Величина коэффициента корреляции r = 0,999.4.

При оценке повторяемости величина относительного стандартного отклонения составила менее 2%.5. По результатам проведенных валидационных испытаний можносделать вывод о том, что разработанная методика определениямелоксикама в биорелевантной среде FaSSIF методом ВЭЖХ является пригодной.1133.6. Валидация методики количественного определения нифедипина вбиорелевантной среде.3.6.1.

Определение специфичности количественной аналитической методики.Специфичность оценивали анализом биорелевантной среды растворенияFaSSIF, не содержащей действующих веществ, а так же анализом плацебо.На хроматограмме не обнаруживалось детектируемых пиков, имеющих время удерживания, эквивалентное времени удерживания действующего вещества.

Все хроматограммы представлены в разделе "ПРИЛОЖЕНИЯ".3.6.2. Аналитическая область методики.Приготовление растворов стандартов, результаты измерения и обработка полученных результатов проводились в соответствии с рекомендациямиUSP [113].Аналитическая область методики количественного определения нифедипина в биорелевантной среде FaSSIF перекрывает интервал от 10% до110% максимальной концентрации испытуемого раствора.3.6.3. Линейность.Номинальное значение (Со) концентрации действующего вещества вусловиях проведения теста «Растворение» для нифедипина составляет:C o  10  500  0,02 мг/мл (20 мкг/мл), где10 – содержание мелоксикама в одной таблетке, мг500 – объем среды растворения, млДля приготовления исходного стандартного раствора нифедипина 0,020г (точная навеска) стандарта нифедипина количественно переносят в мернуюколбу вместимостью 100 мл, растворяют в 10 мл спирта этилового 96%, тщательно перемешивают до полного растворения стандарта и доводят объем дометки FaSSIF рН 6,5.

Полученный раствор имеет концентрацию нифедипина0,2 мг/мл.114Растворы для оценки валидационных характеристик готовили в интервале концентраций 10% - 110% от номинального значения (Со), что соответствует диапазону концентраций 2 мкг/мл – 22 мкг/мл в соответствии с рекомендациями USP по определению линейности при проведении тестов "Растворение" [113].Таблица 49Приготовление растворов для оценки валидационных характеристикИсходный стандартный растворm, мгV, млCконцентрата мг/мл201000,2Растворы для оценки валидационных характеристикКоличество исходного стандартного раствора, мклРазведение,С, мкг/млмл% от изначального Со10010210300106305001010507001014709001018901000102010011001022110Результаты оценки линейности методики приведены в Таблице 50. Прямая линейной зависимости в нормализованных координатах (введено\найдено)растворов нифедипина в среде FaSSIF для оценки валидационных характеристик приведена ниже на Рисунке 22.Таблица 50Оценка линейности методики количественного определения нифедипина всреде растворения FaSSIF рН 6,5КонцентрацияполученногостандартногоКонцентрация полученного стандартного раствора,КонцентрацияполученногостандартногоКонцентрацияполученногостандартного115раствора,мкг/мл (введено)2% от номинального (введено)раствора,мкг/мл (найдено)102,172раствора, %от номинального (найдено)10,86%6306,2531,25%105010,23451,17%147014,39671,98%189018,18490,92%2010020,00100%2211022,39111,95%Рисунок 22.

Оценка линейности методики количественного определения нифедипина в нормализованных координатах «введено-найдено» (FaSSIF рН6,5)Коэффициент корреляции линейной регрессии r=0,9999.Y-intercept (значение точки пересечения с осью ординат) составляет0,011.Slope (угол наклона кривой) равен 1,000.3.6.4. Правильность116Правильность оценивали с применением подхода рассмотрения результатов изучения линейности валидируемой методики: если свободный член вуравнении, статистически достоверно не отличается от нуля, то использование такой методики дает результаты, свободные от систематической ошибки.3.6.5. Прецизионность.Прецизионность оценивалась по результатам не менее 3 определенийдля каждого из 3 уровней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пределах аналитической области методики.Таблица 51Прецизионность, проба 1(inter-day)Кодпробывведено(мкг/мл)найдено(мкг/мл)найдено (мкг/мл),среднее значение(n=3)S.D.RSD,%ε, %2,090,021,084,4614,250,171,181,7622,350,170,781,602,111-10%22,062,0914,101-70%1-110%142214,2114,4322,1522,4222,48Таблица 52Прецезионность, проба 2 (intra-day)Кодпробы2-10%2-70%введено найдено(мкг/мл) (мкг/мл)найдено (мкг/мл),среднее значение(n=6)S.D.RSD, %ε, %2,100,020,784,7514,400,221,502,822,112142,092,1014,3814,5811714,6722,452-110%2222,4222,390,120,531,7722,40Результаты определения правильности и прецизионности соответствовали нормам [2,113], поскольку для всех уровней концентраций величиныотносительного стандартного отклонения (RSD, %) не превышали 2% и относительной погрешности (ε, %) не превышали 5 %3.6.6.

Робастность.Для проверки робастности методики определяли стабильность стандартного раствора нифедипина, приготовленного для количественного определения нифедипина, а так же влияние состава мобильной фазе на пригодностьхроматографической системыХроматографировали свежеприготовленные растворы и после храненияв стеклянной колбе, в защищенном от света месте в течение 24 часов притемпературе не выше 25°С.Стабильность растворов оценивали путем сравнения площадей пиковнифедипина после хроматографирования свежеприготовленных растворов ирастворов после хранения. Площадь пика нифедипина в свежеприготовленном растворе принимали за 100 %. Определяли относительное отклонениеплощади пика (в %) нифедипина от площади, принятой за 100 %.Если отличие Zi от 100 % не превышает 5 %, то раствор считается стабильным в течение испытуемого срока, при невыполнении условия срокихранения растворов сокращаются до срока, в течение которого стабильностьсохраняется.Результаты представлены в таблице 52.Таблица 53Стабильность стандартного раствора нифедипинаКонцентрация раство-Срокхра-Площадь пиканифидипинаКонцентрацияZi,%|Zi анализируе- (Zi=Yi/X 100%|118ра, мг/млнения,(введено, Xi) сутокn=3Среднеезначениемого раствора, мг/мл(найдено, Yi)112932113247,601136027113209112936112941,611128277113062112954112934,62112907711294320112624112581,631125487112573111351111190,651110577111164110643110758,071109720110659Для оценки влияния состава мобильнойфосфорной кислоты,i*100%)20,000100,00%0,00%19,94699,73%0,27%19,94599,72%0,28%19,88299,41%0,59%19,63798,18%1,82%19,56097,80%2,20%фазе готовили 0,027% раствор0,033% раствор фосфорной кислоты (0,030±10%) и0,030% раствор фосфорной кислоты.

Стандартный раствор нифедипина хроматографировали в трех ПФ, оценивая пригодность хроматографической системы.Хроматографическая система считалась пригодной, если: эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику нифедипина - не менее 2000 теоретических тарелок; фактор асимметрии площади пика нифедипина - не менее - 0,8 ине более 1,5; относительное стандартное отклонение площади пика нифедипина- не более 2 % .Результаты средних значений представлены в таблице 53.119Таблица 54Влияние состава ПФ на пригодность хроматографической системыКритериипри-Содержание фосфорной кислоты, %годности0,0270,0300,033ЧТТ238422101592As1,411,291,23RSD, %0,630,560,543.6.7. Валидационные характеристики1. На хроматограммах биорелевантной среды FaSSIF и модельнойсмеси-плацебо отсутствуют пики, по времени удерживания совпадающие с действующим веществом, что является подтверждением специфичности разработанной методики.2.

Полученные значения детектируемых действующих веществ соответствовали нормам, что, в свою очередь, подтверждает правильность валидируемой методики.3. Линейность разработанной методики в диапазоне содержаниядействующего вещества в диапазоне 10% - 110% от заявленногосодержания подтверждена путем анализа модельных смесей свышеуказанным содержанием действующего вещества и последующим построением калибровочной кривой. Величина коэффициента корреляции r = 0,999.4.

При оценке повторяемости величина относительного стандартного отклонения составила менее 2%.5. По результатам проведенных валидационных испытаний можносделать вывод о том, что разработанная методика определениянифедипина в биорелевантной среде FaSSIF методом ВЭЖХ является пригодной.1203.7. Валидация методики количественного определения урсодезоксихолиевой кислоты в биорелевантной среде.3.7.1. Определение специфичности количественной аналитической методики.Специфичность оценивали анализом биорелевантной среды растворенияFaSSIF, не содержащей действующих веществ, а так же анализом плацебо.На хроматограмме не обнаруживалось детектируемых пиков, имеющих время удерживания, эквивалентное времени удерживания действующего вещества.