Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 7

В средувносили микросомальные протеины в концентрации 0,25 мг/мл, 0,2 µМ Р450редуктазуи10мкгL-α-дилаурилфосфатидилхолин.Активацияреакциипроизводилась при добавлении никотинамида аденин динуклеотид фосфата.Кинетика определялась по добавлению пинолина в концентрации от 0,2 до 20 µМдля изоформ и от 0,05 до 100 µМ для человеческих печеночных микросом.

Времяинкубации составило 5 минут для CYP 2D6.1 и CYP 2D6.2, 15 минут для CYP372D6.10 и 10 минут для человеческих печеночных микросом. В качествеингибитора использовали кинидин в концентрации 1 µМ.КоличественноеопределениепроводилиметодомВЭЖХ.Хроматографические условия были следующие:Хроматограф Agilent 1100 seriesКолонка Zorbax фенил, 5 мкм, 250 мм Х 4,6 ммПодвижная фаза 50 мМ аммоний фосфатный буфер (рН = 3) : ацетонитрил(95/5 об/об)Детектор ДМД (214, 254, 280 нм)Температура колонки 40 оСИсследования показали, что аллельная изоформа CYP 2D6.10 (изоформа сосниженной функцией) не активна по отношению к пинолину.

В то время, как поддействием CYP 2D6.1 и CYP 2D6.2 (изоформы с нормальной функцией)происходилообразование6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина.Посравнению с CYP 2D6.1, у изоформы CYP 2D6.2 каталитическая активность ниже.Затем, при добавлении ингибитора CYP 2D6 хинидина наблюдали полнуюблокировку О-деметилирования пинолина, что указывает на селективностьизофермента к субстрату.1.4.3.1.

Определение in vivoДальнейшее исследование in vivo на мышах проводилось с цельюподтверждения результатов ex vivo и, чтобы сравнить активность изоферментаCYP 2D6 у мышей дикого типа и Tg-CYP 2D6.Для анализа были выбраны взрослые мыши (7 недель) дикого типа и TgCYP 2D6, средний вес 22 – 25 г. Пинолин вводился интраперитонеально в дозеоколо 750 мкг. В качестве пробы отбиралась моча через 24 ч после введенияпинолина.38КоличественноеопределениепроводилосьметодомLC-MS/MS.Хроматографические условия были следующие:Хроматограф Shimadzu prominence HPLC systemДетектор API 3000 turbo ionspray ionization triple-quadrupole massspectrometerКолонка Luna фенил-гексил (50 Х 4,6 мм, 3 мкм)Подвижная фаза буфер А (водный раствор муравьиной кислоты 0,02 %)буфер В (метанольный раствор муравьной кислоты 0,02%). Хроматографированиепроходило в градиентном режиме с повышением соотношения буфера В от 5 до80 % до 9 минуты, затем устанавливался изократический режим на 2 минуты(буфер В 80 %) и с 11,5 до 15 минуты концентрация буфера В устанавливалась на5 %.Скорость потока 0,3 мл/мин.Анализ подтвердил результаты ex vivo испытания.

По результатам былсделан вывод, что у мышей О-деметилирование проходит под действием CYP2D6.Около 99 % метаболита пинолина выводится из организма с мочой,следовательно, в качестве пробы можно использовать этот биообъект. У мышейдикого типа активность CYP 2D6 была выше, чем у Tg-CYP 2D6.Подтип генотипаАктивностьизоферментаEx vivoЧеловеческие«распространенные»Средняяпеченочные микросомы метаболизаторыАллельные изоформы:CYP 2D6.1«распространенные»СредняяCYP 2D6.2метаболизаторыНиже среднегоCYP 2D6.10«медленные»Нетметаболизаторы39In vivoМыши дикого типа«распространенные»СредняяметаболизаторыМыши Tg-CYP 2D6«медленные»НизкаяметаболизаторыТаблица 4 - Сводная таблица существующих метолов количественногоопределение пинолина ex vivo и in vivo [51]Логичным продолжением рассмотренного исследования будет изучение поопределению эндогенного пинолина в моче у человека для оценки активностиизофермента цитохрома Р450 CYP 2D6.

У такой методики определенияактивности CYP 2D6 не будет недостатков, присущих методикам с применениемэкзогенных веществ, которые могут оказывать гипотензивное, антиаритмическоедействия, а также могут вызывать аллергические реакции.1.5. Метод ВЭЖХ-МС/МСВысокоэффективная жидкостная хроматография – метод колоночнойхроматографии, в котором жидкая подвижная фаза под высоким давлениемподается в колонку, заполненную сорбентом (неподвижной фазой) [10]. МетодВЭЖХ широко применяется в фармакопейном анализе для качественного иколичественного анализа. В биоаналитических методиках ВЭЖХ также успешноиспользуется как при анализе ЛС и метаболитов, ксенобиотиков, так иэндогенных веществ [18].В качестве детекторов в зависимости от требуемой чувствительности иселективностиприменяютсярефрактометрические,спектрофотометрические,кондуктометрические,флуориметрические,масс-спектрометрическиедетекторы и т.

д. [13]. Поскольку в биоаналитических методиках требуетсявысокая селективность и чувствительность, зачастую в качестве детекторавыбирают масс-спектрометрический детектор.Масс-спектрометрия - это физический метод измерения отношения массызаряженных частиц материи (ионов) к их заряду.

Существенное отличие масс-40спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит втом, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируютизлучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а массспектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрияизмеряет соотношение массы к заряду. Для этого используются законы движениязаряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. [13]Для того, чтобы ионизовать органическое вещество его нужно сначала изконденсированной фазы перевести в газовую.

Затем, молекулы подвергаютсябомбардировке пучком электронов с образованием положительно заряженныхионов. Также существуют и другие методы ионизации.На следующем этапе происходит сортировка ионов по отношению массы кзаряду (m/z) в масс-анализаторе. Поскольку в разработанной методикеприменялсятандемныймасс-спектрометрическийдетекторстройнымквадруполем, то более подробно будет рассмотрен масс-анализатор квадруполь сосравнением с тройным квадруполем.Квадруполь представляет собой 4 стержня, к которым попарно впротивоположной полярности подается определенная комбинация постояного ирадиочастотного переменного напряжения [21]. Ионы, влетающие в анализаторчерез отверстие (1) попадают в гиперболическое поле, в котором в зависимости ототношения m/z происходит отсеивание некоторых ионов (3), оставшиеся ионывылетают через отверстие (2) (рис.

5)Детекторионов41Рисунок 5 - Масс-анализатор квадруполь.Тандемный масс-спектрометр (тройной квадруполь) состоит из двухквадруполей, соединенных октопольной реакционной ячейкой. В первыйквадруполь попадают ионизированные молекулы, и происходит отсеивание частиионов, затем в октопольной реакционной ячейке проводится повторная ионизацияи полученные молекулы попадают во второй квадруполь, где снова отсеиваетсячасть ионов. Оставшиеся ионизированные молекулы попадают в детектор. Нарисунке 6 приведено сравнение проведения анализа на квадруполе и на тройномквадруполе [21].Рисунок 6 - Проведение анализа на квадруполе и тройном квадруполе.42ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Оборудование и материалы2.1.1. Материалы2.1.1.1. Стандарты определяемых веществ стандартный образец пинолина (Sigma-Aldrich кат. № 371858); стандартный образец 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина (AuroraFine Chemicals кат. № А06.795.158); стандартный образец галантамина гидробромида (Sigma-Aldrich кат.№ Y0001279).2.1.1.2. Биологическая матрицаБиологическая матрица для приготовления калибровочных образцов иобразцов контроля качества – плазма крови человека и моча.2.1.1.3. Реактивы ацетонитрил (supergradient, Scharlau, Испания); спирт метиловый (extra pure, Scharlau, Испания); муравьиная кислота (for LC-MS, Merck Millipore, США); аммония формиат (for LC-MS, Merck Millipore, США); этилацетат (extra pure, Scharlau, Испания); деионизированная вода, электрическое сопротивление 18,2 Мом*см,Millipore simplicity UV (Merck-Millipore, США); триэтиламин (reagent grade, Scharlau, Испания); натрия тетраборат (extra pure, Scharlau, Испания); борная кислота (extra pure, Scharlau, Испания).2.1.2.

Оборудование жидкостной хроматограф Agilent 1290 Infinity оснащенный градиентнымнасосом,дегазатором,автосамплером,селективным детектором Agilent 6460, США;трехквадрупольныммасс-43 предколонка Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 12,5 x 2,1 мм, 5 мкм (кат. №821125-936) колонка Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 RRHD 100 x 2,1 мм, 1,8 мкм (кат. №959758-902K) картридж Chromabond® С18 для ТФЭ, США весы аналитические ES 225 SMDR, Швейцария; рН-метр Seven Multi, Mettler Toledo, Швейцария; центрифуга Eppendorf 5415D, Германия; встряхиватель типа вортекс ELMI, Латвия; концентратор Eppendorf Concentrator plus, Германия; дозаторы переменного объема Eppendorf 10 – 100 мкл и 100 – 1000 мкл,Германия; холодильник Indesit, SD 125, Россия; морозильник для плазмы Sanyo, Япония; система водоподготовки Micropure, ThermoScientific, США.2.2.

Разработанная методикаХроматограф: Agilent 1290 Infinity;Предколонка: Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 12,5 x 2,1 мм, 5 мкм (кат. № 821125936);Колонка: Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 RRHD 100 x 2,1 мм, 1,8 мкм (кат.№ 959758-902K);Температура колонки: (50 ± 1) ºС;Скорость потока: 0,4 мл/мин;Детектирование: МС/МС, MRM-переходы для пинолина 203,2 m/z → 174,0 m/z,для 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина 189,2 m/z → 160,0 m/z, длягалантамина 288,3 m/z → 213,0 m/z;Метод ионизации: электроспрей (ESI) в положительной полярности;Объем пробы: 5 мкл.Ориентировочные времена удерживания в плазме крови:446-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин – около 1,1 мин;пинолин – около 5,0 мин;галантамин – около 2,4 мин.Ориентировочные времена удерживания в моче:6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин – около 1,1 мин;пинолин – около 5,0 мин;галантамин – около 2,4 мин.Время хроматографирования: 14 минПодвижная фаза:Элюент А: 5 мМ аммония формиата и 0,01 % муравьиной кислоты в воде.Элюент B: 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.МетодикаСтабилизируют систему ВЭЖХ в условиях начального градиента (элюент А: элюент В = 95 % : 5 %) в течение 15 мин.Градиентная программа:Время, минЭлюент А, % (об/об)Элюент В, % (об/об)09551,5955270308,5406012955149552.3.