Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 6

Данное ЛС также не зарегистрировано на территории РФ.311.3.2. Количественное определение трамадолаАнальгетическое действие трамадола главным образом обусловлено егометаболитом М1, у которого сродство к µ-рецептору в 200 раз выше, чем у самогопрепарата. Известно, что М1 образуется благодаря изоферменту CYP 2D6 [76].Например, при применении трамадола с пароксантином (ингибитор CYP 2D6)наблюдается уменьшение анальгетического действия, так как активностьизофермента снижена [77].При изучении фармакокинетики трамадола путем сравнения метаболическихиндексов трамадола/М1 к декстрометорфану/декстрорфану наблюдалась слабаякорреляция. В дальнейшем исследовании было обнаружено, что в метаболизметрамадола помимо изофермента CYP 2D6, также участвуют CYP2B6 и CYP2C19,и для достижения хороших результатов увеличивают дозу, что приводит к болеечастому проявлению НЛР.

Трамадол относится к наркотическим ЛС, что такжезатрудняет применение его в анализах. Таким образом, применение трамадола вфенотипировании ограничено.1.3.3. Количественное определение метопрололаОсновными путями метаболизма метапролола являются О-деметилирование,α-гидроксилирование и N-деалкилирование. Для фенотипирования CYP 2D6достаточно100гидроксилированиемг,иоколо70-80небольшой%метаболизмапроцентнаприходятсяО-деметилированиенаα[57].Различными исследованиями доказано, что α-гидроксилирование происходиттолько за счет CYP 2D6, в то время как в О-деметилировании могут участвоватьи другие изоферменты.При определении в моче отношения метопролола к α-гидроксиметопрололунаблюдается корреляция между pH и метаболическим индексом [27].

Такимобразом, фенотипирование с метопрололом в моче неубедительно.Следующее исследование, в котором после приема дексторметорфана (22 мг)или метапролола (100 мг) с дальнейшим отбором крови в течение 8 часов,32показалохорошуюкорреляциюмеждуиндексомметопролол/α-гидроксиметопролол и декстрометорфан/декстрофан.В целях фенотипирования метопролол может применяться только приопределении в плазме крови. Также недостатком этого метода является то, чтометопролол снижает давление.1.3.4. Количественное определение декстрометорфанаДекстрометорфанявляетсяантагонистомопиоидныхрецепторов,применяется в качестве противокашлевого и обезболивающего препарата.Благодаря своей безопасности, средним НЛР, декстрометорфан хорошо изучен вкачестве маркера для определения активности CYP 2D6.

К сожалению, вгосударственномреестрелекарственныхсредствРФдекстрометорфанпредставлен только в комбинации с другими ЛС, следовательно, в нашей странедексрометорфан недоступен.Декстрометорфанпреимущественнометаболизируетсяприучастиицитохрома CYP 2D6 в декстрофан путём О-деметилирования [69]. Другиеизоферменты, такие как CYP 3А4, CYP 3А5, CYP 3А7, CYP 2С9, CYP 2С19,катализируют превращение декстрометорфана внеактивный 3-метоксиморфинан.Декстрофан и 3-метоксиморфинан деметилируются в гидроксиморфинан. Всеобразующиеся метаболиты экскретируются с мочой, в основном ввидеглюкуронидов [25, 85].На сегодняшний день разработано много методик по определениюактивности, используя в качестве маркерного субстрата декстрометорфан, приэтом в качестве пробы можно отбирать различные биологические жидкости:мочу, кровь и слюну. Такие методики имеют множество достоинств по сравнениюс рассмотренными выше, но поскольку методики инвазивные, могут развитьсяНЛР, а также стоит учитывать индивидуальную непереносимость ЛС.

Учитывая,что на территории РФ декстрометорфан представлен только в виде комбинаций сдругими лекарственными средствами, его не получится применить дляфенотипирования изофермента CYP 2D6.331.4. Определение активности СУР2D6 по отношению пинолин/6гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболинДля фенотипирования изофермента CYP 2D6 были разработаны ивалидированы различные методики.

Оригинальные тесты с дебризохином испартеином постепенно заменились клинически более надежными тестами сдекстрометорфаном и метопрололом. Затем соперничество между методамифенотипирования отошло на второй план, так как стали быстро внедрятьсяметоды генотипирования, основанные на ДНК. Несмотря на развитие ПЦР запоследние десять лет, остается проблема прогнозирования фенотипа CYP 2D6 изметодовгенотипирования,основанныхнаДНК.Современныеметодыфенотипирования по определению экзогенных «маркеров» могут приводить кразвитию НЛР.

Также нужно учитывать, что на территории РФ из всех возможныхсубстратов зарегистрированы только 2 ЛС: трамадол и метопролол. Возможно, чтопоиск эндогенных субстратов для CYP 2D6 будет интересен не только длярасширения знаний о работе изоферментов цитохрома, но и обретет ипрактическое значение для новой методики фенотипирования, которой не будутприсущи недостатки ранее разработанных методик [15, 16].1.4.1 Скрининг эндогенных субстратов CYP 2D6Проводится много исследований по поиску эндогенных веществ, которыеметаболизируются только одним изоферментом. Широкое исследование провелAi-MingYu с коллегами по поиску эндогенных веществ, специфичных изоферментуCYP 2D6. В своем исследовании ученые рассмотрели ряд эндогенных веществпотенциально являющиеся специфическими субстратами для CYP 2D6.

Былоустановлено, что изофермент CYP 2D6 не значительно метаболизируетэндогенныефенилэтиламины(2-фенилэтиламин,октопамин,синефрин,метанефрин и норметанефрин), индолэтиламины (триптамин, серотонин, 6метокситриптамин и мелатонин) и β-карболины (гарман, норгарман и триптолин).Однако, индолметиламин 5-метокси-N,N-диметилтриптамин и пинолин (6метокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин) показали относительно высокое сродство34к CYP 2D6 и О-деметилировались только под действием CYP 2D6.

Придобавлении к исходным веществам моноклональных антител против CYP 2D6, Одеметилирование 5-метокси-N,N-диметилтриптамина и пинолина не наблюдалось.Специфичность пинолина по отношению к CYP 2D6 составляет около 99 %относительно других изоферментов цитохрома Р450.Пинолин подвергается О-деметилированию с образованием метаболита 6гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина (рис. 3).CYP 2D66-гидрокси-1, 2, 3, 4,тетрагидро-β-карболинПинолинРисунок 3 - Метаболизм пинолина посредством изофермента CYP 2D6.1.4.2.

Физические, химические и биохимические свойства пинолинаХимическое название пинолина – 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин.Молекулярная масса составляет 202,26 г/моль. Температура плавления от 216 до224 °C. Соединение проявляет основные свойства, значение рКа составляет 9,04.Коэффициент липофильности LogP = 1,25. Умеренно растворим в воде (1 : 35).Пинолин(отлат.pineale-шишковидный)являетсяэндогеннымсоединением и находится в мозгу млекопитающих и других тканях (например,сетчатка) с широким диапазоном концентраций от 2 нг/г до 21 мкг/г [11, 75].Также пинолин встречается растениях, например, среди β-карболинов в составеPeganum harmala [78]. По химической структуре пинолин относится к 1,2,3,4тетрагидро-β-карболинам с метоксильным заместителем в положении 6 (рис.

4).35Рисунок 4. Химическая структура пинолина.Как и весь класс β-карболинов, пинолин привлекает пристальное вниманиеисследователей, поскольку он участвует в разнообразных биохимическихреакциях, которые могут найти практической применение в медицине ифармацевтике. Пинолин является метаболитом мелатонина, и оба веществапроявляют схожие свойства, поскольку в их структуре лежит индольное ядро. Поданным исследования [75] пинолин наряду с мелатонином нейтрализуетсвободные радикалы и тем самым, препятствует развитию окислительногостресса.

Головной мозг содержит большое количество полиненасыщенныхжирных кислот, которые легко подвергаются свободнорадикальному окислению.Мелатонин и пинолин защищают ткани мозга от свободных радикалов иучаствуют в поддержании баланса между появлением свободных радикалов изащитной системой.Было показано [75], что пинолин ингибирует моноаминаксидазу А иобратный захват серотонина. Подобно антидепрессантам, пинолин можетувеличиватьколичествосеротониновыхрецепторовипроявлятьфармакологические эффекты серотонинэргических ЛС. Из исследования посравнениюпинолина,имипраминагидрохлоридаиамитриптилинавповеденческих тестах на крысах [75] был сделан вывод, что действие пинолинасхоже с препаратами сравнения и в дальнейшем это вещество можетрассматриваться как потенциальный антидепрессант.Хорошо известно, что некоторые имидазолиновые соединения могутстимулировать выработку инсулина посредством активации I3 имидазолиновых36рецепторов β-клеток поджелудочной железы.

Основываясь на данных, чтопроизводные β-карболина активируют рецепторы I1 и I2 в мозгу, J. Cooper сколлегами [30] проверили гипотезу, что гарман и пинолин могут связываться срецепторами I3 поджелудочной железы. По данным исследования гарман ипинолин повышают секрецию инсулина. С повышением доз было замечено иповышение секреции инсулина, то есть эффект является дозозависимым. Такимобразом,производныеβ-карболина,втомчислеипинолин,могутрассматриваться в качестве препаратов, повышающих секрецию инсулина.1.4.3. Существующие методики определения пинолина1.4.3.1. Определение ex vivoКак сообщалось ранее, эндогенное вещество пинолин подвергается Одеметилированиюмикросомамипеченииегобиотрансформацияпреимущественно катализируется изоферментом цитохрома Р450 CYP 2D6.Исследователи отделения фармацевтических наук университета в Баффало(США) изучили, как влияет статус изофермента CYP 2D6 на О-деметилированиепинолина и оценили, может ли пинолин применяться для определения активностиCYP 2D6.

Также исследовали функциональные различия между аллельнымиизоформами CYP 2D6.1, CYP 2D6.2, CYP 2D6.10. Затем проводилисьисследование кинетики, ингибирования и корреляции для определения роли CYP2D6 в биотрансформации пинолина.Инкубация аллельных изоформ CYP 2D6 и человеческих печеночныхмикросом проводилась в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, 37 оС [51, 42].