Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 3

Также с развитием «геномной эры» были изученыгенетические основы метаболизма ЛС среди индивидов и популяций. В будущемизучение метаболизма будет зависеть от появления и развития новых технологий.1.1.2. Системы и ферменты, участвующие в метаболизме ЛС1.1.2.1. Основные фазы метаболизма. Суперсемейство цитохром Р450Основная функция метаболизма ЛС заключается в том, чтобы облегчитьвыведениесоединенийизорганизма,такимобразом,предотвращаянежелательное накопление чужеродных соединений или потенциально токсичныхконцентрацийэндогенныхсоединений.описываетсяколичественнымиЭтафизиологическаяфармакокинетическимифункциятерминами−биодоступность и клиренс.

Биодоступность показывает количество принятогоЛС, которое достигло системного кровотока, т. е. количество абсорбированногоЛС минус пресистемный метаболизм. Степень выведения ЛС из системногокровотока и скорость постсистемного метаболизма характеризует клиренс.Биодоступность и клиренс в совокупности влияют на общее воздействие ЛС на14организм и количественно характеризуются площадью под фармакокинетическойкривой (AUC) (рис. 1).Рисунок 1 - Фармакокинетическая кривая (a) и путь перорального ЛС (b).Каждое соединение обычно биотрансформируется через ряд параллельныхи/или последовательных реакций, через так называемый метаболический путь и,при этом, на разных стадиях образуются различные соединения. Общийметаболизм любого соединения является суммой всех доступных путейметаболизма ЛС.

Условно реакции метаболизма можно разделить на «I фазу» и«II фазу».I фаза метаболизма включает в себя функциональные реакции (окисление,восстановление, гидролиз). С помощью этих реакций вводятся новые полярныефункциональные группы, изменяются существующие группы с повышениемполярности или гидролизуются закрытые полярные группы.IIфазахарактеризуетсясульфонирование,реакциямиконъюгациясконъюгации(глюкуронирование,глицином/глютамином/глютатионом,ацетилирование, метилирование).

После конъюгации резко увеличиваетсяполярность соединения, что способствует лучшему выведению.15Следует отметить, что все реакции биотрансформации проходят в оченьмягких условиях: нейтральный рН, приблизительно 37°С, водный растворитель иатмосферное давление. Только благодаря ферментам, участвующим в реакциях вкачестве катализаторов, реакции протекают в таких условиях.При определении биодоступности и фармакокинетики ЛС следует учитыватьроль различных семейств ферментов, которые участвуют в его метаболизме.Оценивают метаболизм ЛС по тем ферментам, которые проявляют большуюактивность по отношению к субстрату.В реакциях I фазы метаболизма в качестве катализаторов участвуютразличныеклассыферментов.Посколькуизоферментысуперсемействацитохрома Р450 широко представлены в организме, они доминируют средидругих ферментов по вкладу в биотрансформацию ЛС.

Подсемейства CYP 1, CYP2 и CYP 3 метаболизируют большинство ЛС и ксенобиотиков [46, 97]. Дваважных класса ферментов локализованы в эндоплазматическом ретикулуме,рядом с цитохромом Р450: флавин-содержащие монооксигеназы, которыеучаствуютвреакцияхдифосфат глюкуронилтрансферазы,уридин-5-дифосфорнойиN-которыеглюкуроновойS-окисленияикатализируютконъюгациюкислотой.Вдополнениеуридин-5ксэтимсемействам, существуют N-ацетил трансферазы, сульфотрансферазы, глутатионтрансферазы, алкоголь дегидрогиназы и альдегид дегидрогиназы.

Почти всеметаболические пути включают один или несколько ферментов – большинствовключают цитохром Р450.Цитохром Р450 является одним из наиболее важных семейств ферментов,которые участвуют в регуляции фармакологически активных, токсичных ипотенциальнотоксичныхксенобиотиков.Ферментыцитохромаявляютсямембранно-связанными гемопротеинами, которые соединяются с гладкимэндоплазматическим ретикулумом.Известно, чтосубстратамицитохромаявляются соединения с различными функциональными группами, которыеподвергаются метаболизму путем окисления.16Цитохром делится на подсемейства в зависимости от общей аминокислотнойпоследовательности. Более 50 различных изоферментов идентифицированы учеловека. Среди них проявляют активность в метаболизме большинства ЛСследующие изоферменты: CYP 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 2J2, 3A4,3A5, 4F2, 4F3a, 4F3b и 4F12. Фактически CYP 1A2, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6 и 3A4являютсянаиболееважнымиизоферментамиприопределениифармакокинетических параметров.Эта номенклатура используется не только у человека, но и у других видов.Как правило, у различных видов изоферменты имеют схожие между собойструктуру, функции и название, но, важно отметить, что они не идентичнычеловеческимформам.Даженебольшоеразличиеваминокислотнойпоследовательности может повлиять на сродство к субстрату и на способностьфермента метаболизировать субстрат и/или регион специфичное место молекулы.Изучая метаболизм, следует обращать внимание на стадии биотрансформации,которым подвергается субстрат, а также определять ферменты, под действиемкоторых происходят такие трансформации.

Фармакокинетические показатели,полученные в испытаниях in vivo на мышах или других лабораторных животных,не всегда коррелируют с показателями человека. Для прогнозированияфармакокинетики ЛС у человека нужно проводить анализ на разных видахживотных, а также учитывать данные, полученные в испытания in vitro и in silico[84, 89].Как семейство, несколько изоферментов вместе участвуют в окислении ибиотрансформации сложных соединения. Однако у отдельных изоферментов естьтенденция к большей селективности к субстратам с определенными свойствами,что позволяет дифференцировать их (табл. 1) [64, 65]. CYP 1A1 часто участвует вметаболизме арильных углеводов [40]. У CYP 1A1 и CYP 1A2 частично совпадаетсродство к субстратам; однако,CYP 1A2 преимущественно метаболизируетполициклические ароматические углеводы.

Как CYP 1A1, так и CYP 1A2участвуют в биотрансформации проканцерогенов в канцерогены. Было показано,17что CYP 1A2 является основным ферментом, метаболизирующим такие ЛС, какфенацетин и теофиллин. CYP 2A6 отдает предпочтение более мелким,нейтральным, менее липофильным молекулам, таким как кетоны и нитрозамины.CYP 2C9 и CYP 2C19 могут метаболизировать кислые молекулы. CYP 2C9участвует в реакциях О-деметилирования фенольных радикалов, окисленииароматических метил радикалов, радикалов, содержащих атом серы, Nдеалкилировании [84]. Напротив, CYP 2D6 может метаболизировать основныемолекулы с атомом азота (флуоксетин, нортриптилин, декстрометорфан ибуфуралол), а также катализирует реакции О-деметилирования, окисления метилрадикаловифенолО-деметилирования.CYP2E1эффективенвбиотрансформации малых молекул (этанол, ацетаминофен, халотан и паранитрофенол), а CYP 3A4 – больших, липофильных молекул (симвастатин,тестостерон, кортизол, циклоспорин и мидазолам) [47, 64].

Также CYP 3A4проявляетактивностьприN-деалкилировании,гидроксилированииароматических систем и окислении радикалов, содержащих серу.ИзоферментCYP1A1, 1A2CYP2C9CYP2C19CYP 2D6Свойство субстратаПлоскаялипофильная;нейтральная или основнаямолекулаКислотнаямолекуласредних размеровОсновнаямолекуласредних размеровОсновнаямолекуласреднихразмеровспротонируемым атомомазотаМаленькая, нейтральнаямолекулаБольшая,липофильнаямолекулаПример субстратаФенацетин, дапсон, такрин,рамелтеон,кофеин,теофиллинДиклофенак,варфарин,толбутамин, лозартан(S)-мефетоин, омепразолФлуоксетин,декстрометорфан,нортриптилин, буфуралолПаранитрофенол,этанол,хлорзоксазонТестостерон, циклоспорин А,CYP3A4нифедипин,мидазолам,симвастатин, кортизолТаблица 1 - Цитохром Р450 и его субстратная селективность.CYP2E1183D структура белка субстрата уникальна для каждого изофермента и, такимобразом, контролируются участки связывания с лигандами.

Субстраты иингибиторы должны быть в состоянии вступить во взаимодействие сосвязывающим участком. Несмотря на то, что у лиганда и активного центра белкаесть конформационная гибкость, исследования показали, что эта гибкостьограничена атомными, водородными и прочими связями. Таким образом, каждыйизофермент ограничен диапазоном лигандов, которые могут взаимодействовать сактивным центром, и эти ограничения определяют субстратную, ингибиторную ирегиоселективность каждого изофермента цитохрома Р450.Селективность изофермента относится к способности активного центрасвязаться с лигандом.

Например, потенциальный лиганд не сможет связаться сактивным центром, если он не подходит по структуре связывающему иликаталитическому участкам. Также может быть, что лиганд подходит по размеру,но у него нет дополнительных функциональных групп, необходимых длясвязывания с изоферментом. С помощью рационального изучения лигандов,окисленных конкретными изоформами цитохрома Р450 можно разработатьнадежные параметры для прогнозирования специфичности [63, 90]. По даннымисследования подготовлено древо решений для прогнозирования селективностиосновных изоферментов (рис.

2).19ВсепотенциальныесубстратыДаПланарная молекула(ароматическоекольцо)CYP1A2НетНетБольшаямолекулаНетСредняямолекулаМаленькаямолекулаДаДаНетДаНейтральнаяилиосновнаяCYP2C8НетОсновнаяДаДаНетНейтральнаяНейтральная,основная иликислотнаяНетДаCYP3A4КислотнаяCYP2E1илиCYP2A6НетCYP2C9ДаCYP2C19ДаCYP26^Рисунок 2 - Древо решений для прогнозирования селективности изоферментацитохрома Р450.На базе быстро развивающихся компьютерных технологий, ученыеразрабатывают методы прогнозирования селективности изоферментов in silico.