Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS)

Министерство здравоохранения Российской ФедерацииГосударственное бюджетное образовательное учреждениевысшего профессионального образованияПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙУНИВЕРСИТЕТ имени И.М. СЕЧЕНОВАНа правах рукописиАБДРАШИТОВРустем ХамзиевичРАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИНОЛИНАИ ЕГО МЕТАБОЛИТА МЕТОДОМ LC/MS/MS14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозияДиссертацияна соискание ученой степеникандидата фармацевтических наукНаучный руководитель:доктор фармацевтических наук, профессорРаменская Галина ВладиславовнаМосква – 20162ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ5ВВЕДЕНИЕ6ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ111.1.Система метаболизма (биотрансформации) лекарственных средств111.1.1.

История изучения метаболизма лекарственных препаратов111.1.2. Системы и ферменты, участвующие в метаболизме ЛС131.1.2.1. Основные фазы метаболизма. Суперсемейство цитохром Р450131.2.Функциональные особенности и полиморфизм изофермента CYP 2D6 211.2.1. β-блокаторы как субстрат CYP 2D6241.2.2. Метаболизм антипсихотических ЛС с участием CYP 2D6251.2.3.

Влияние заболеваний печени на активность CYP 2D6261.3.Методы определения активности СУР 2D6 (фенотипирование)271.3.1. Количественное определение дебризохина и спартеина301.3.2. Количественное определение трамадола311.3.3. Количественное определение метопролола311.3.4. Количественное определение декстрометорфана321.4.Определение активности CYP 2D6 по отношениюпинолин/6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин331.4.1.

Скрининг эндогенных субстратов CYP 2D6331.4.2. Физические, химические и биохимические свойства пинолина341.4.3. Существующие методики определения пинолина361.4.3.1. Определение ex vivo361.4.3.2. Определение in vivo37Метод ВЭЖХ-МС/МС391.5.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)42ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ422.1. Оборудование и материалы422.1.1.

Материалы422.1.1.1. Стандарты определяемых веществ4232.1.1.2. Биологическая матрица422.1.1.3. Реактивы422.1.2. Оборудование422.2. Разработанная методика432.3. Дизайн фармакологической части44ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ463.1 Разработка методики определения отношения пинолин и6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин463.1.1. Выбор внутреннего стандарта463.1.2. Пробоподготовка473.1.2.1. Отбор проб. Пробоподготовка473.1.2.2. Пробоподготовка плазмы крови483.1.2.3. Пробоподготовка мочи503.1.2.4. Выводы по результатам пробопоготовки513.1.3.

Хроматографические условия523.1.4. Масс-спектр условия543.2. Валидация методики определения пинолина и6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин553.2.1. Параметры пригодности хроматографической системы553.2.1.1. Селективность563.2.1.2. Линейность зависимости отклика от концентраций определяемыхвеществ573.2.1.2.1. Получение данных для построения калибровочного графика583.2.1.2.2. Построение калибровочного графика583.2.1.2.3.

Оценка линейности583.2.1.3. Оценка правильности и прецизионности методики623.2.1.4. Оценка предела количественного определения633.2.1.5. Эффект матрицы643.2.1.6. Стабильность анализируемых веществ663.2.1.6.1. Стабильность стандартного раствора6643.2.1.6.2. Стабильность пинолина и его метаболита в составебиологической матрицы при хранении в замороженном состоянии673.2.1.6.3.

Стабильность пинолина и его метаболита после пробоподготовки 683.2.1.7. Тест на разведение3.3. Зависимость активности изофермента CYP 2D6 и70измененияотношения пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина713.3.1. Изучение влияния почечной патологии на активностьизофермента CYP 2D6733.3.2.

Изменение активности изофермента CYP 2D6 под действиемингибиторов и индукторов75ОБЩИЕ ВЫВОДЫ77СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ795СПИСОК СОКРАЩЕНИЙCYP – cytochrome P450 – цитохром Р450НЛР – нежелательные лекарственные реакцииLC/MS/MS – ВЭЖХ-МС/МС – высокоэффективная жидкостная хроматография стандемным масс-спектрометрическим детектированиемЛС – лекарственное средствоFDA – Food and Drug Administration – Управление по санитарному надзору закачеством пищевых продуктов и медикаментовMEGX – monoethylglycinexylidide – моноэтил-глицин-ксилидитHPLC – ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматографияМ1 – моно-О-дезметилтрамадолДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаПЦР – полимеразная цепная реакцияТФЭ – твердофазная экстракцияMRM – multiple reaction monitoring – мониторинг множественных реакцийEMA – European Medicines Agency – Европейское агентство лекарственныхсредств6ВВЕДЕНИЕАктуальность темыС проблемой частого развития нежелательных лекарственных реакцийсталкивается каждый врач и частично решить данную проблему позволяютперсонализированные подходы к фармакотерапии.

Одним из инструментовперсонализированноймедициныявляетсяизучениефармакокинетикилекарственных средств.Одним из основных фармакокинетических процессов, определяющихиндивидуальныйфармакологическийответ,являетсяметаболизм,илибиотрансформация лекарственных средств.

Большой вклад в метаболизм многихксенобиокиков вносит система цитохрома P450, которая состоих из множестваизоферментов, отвечающих за биотрансформацию как экзогенных, так иэндогенных веществ. Однако в метаболизме лекарственных средств принимаютучастие ферменты семейств I, II, III. Наиболее важными для метаболизма ЛС ихорошо изученными изоферментами цитохрома Р450 являются следующиеизоферменты: CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6, CYP 2B6, CYP 2D6, CYP 2C9, CYP2C19, CYP 2E1, CYP 3A4 [11].Определение активности того или иного фермента метаболизма ЛС пофармакокинетике его специфического субстрата («маркерного» субстрата) и егометаболита называется фенотипированием.

Существуют методики определенияизоферментов с применением экзогенных или эндогенных «маркеров».В настоящее время за рубежом для оценки активности CYP 2D6 в научныхцелях широко используется экзогенное вещество декстрометорфан. Данный тестобладаетрядомвыраженныхнедостатков,такихкакнеобходимостьвнутривенного или перорального введения препарата, применение которогосопряженосрискомразвитияНЛР.Такжедекстрометорфанввидемонокомпонентного препарата не зарегистрирован на территории РФ, что делаетпрактически невозможным его применение в клинической практике.В связи с этим более перспективны методы оценки активности CYP 2D6 поконцентрации в биологических жидкостях эндогенного субстрата и его7метаболита. Такими субстратами являются пинолин и его метаболит 6-гидрокси1, 2, 3, 4,- тетрагидро-β-карболин, который образуются преимущественно поддействием CYP 2D6 [55].

Поскольку определение эндогенного веществаисключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, то упациентов не будут развиваться НЛР и такая методика будет более безопаснойдля больного.Все вышесказанное определяет актуальность настоящего исследования.Цель исследования – разработать методику количественного определенияпинолина и его метаболита методом LC/MS/MS для оценки активностиизофермента CYP 2D6 с целью рационализации фармакотерапии.Задачи исследования:1. Выявить и теоретически обобщить, согласно результатам отечественных изарубежныхлитературных источников, данные, отражающие применениеразличных методик определения активности изофермента CYP 2D6 методомВЭЖХ.2. Подобрать оптимальные условия количественного определения пинолинаи 6-гидрокси-1, 2, 3, 4,-тетрагидро-β-карболина в биологических жидкостяхметодом LC/MS/MS.3.

Провести валидацию разработанной методики.4. Изучить активность CYP 2D6 у пациентов с помощью разработаннойметодики.5. Изучить изменение активности CYP 2D6 у пациентов при приемеингибиторов активности данного изофермента.6. Сделать вывод о возможности использования данной методики дляопределения изменений активности при приеме ингибиторов активности CYP2D6.Научная новизна.

В данной работе впервые представлены разработанные ивалидированные методики количественного определения пинолина и егометаболита 6-гидрокси-1, 2, 3, 4,-тетрагидро-β-карболина в плазме крови и мочечеловека в диапазоне концентраций от 250 до 1500 пг/мл. На основании8экспериментальных данных сделан вывод о возможности определения активностиCYP 2D6 у пациентов с помощью разработанной методики.

Также применениеданной методики количественного определения возможно при назначенииингибиторов изофермента CYP 2D6.Методология и методы исследования. В ходе выполнения работы былипримененыметодывысокоэффективнойпробоподготовкижидкостнойствердофазнойхроматографиисэкстракциейтандемнымимасс-спектрометрическим детектированием.Теоретическая и практическая значимость результатов исследования.Разработанные биоаналитические методики были внедрены в практическуюдеятельность в лаборатории клинической фармакологии ФГБУ ГНЦ «Институтиммунологии» ФМБА России и в филиале «Клиническая фармакология» ФГБУННЦБМТ ФМБА России.Степень достоверности результатов исследования.