Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан, страница 2
Описание файла
PDF-файл из архива "Коллоидно-химические свойства смесей лизоцим-ПАВ в системе водный раствор-октан", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Модель предполагает, что полипептидная цепь врастворе является гибкой, и мицеллоподобные кластеры ПАВ располагаютсявдоль развернутой пептидной цепи. Так, при изучении методами флюоресценциии электронного спинового резонанса, индуцированного анионным ПАВ додецилсульфатом натрия (SDS) разворачивания макромолекулы бычьего сывороточногоальбумина (BSA), установлено [9], что белок индуцирует образование мицеллоподобных агрегатов вдоль развернутой полипептидной цепи. Схема процессапредставлена на рис. 1. Методом динамического светорассеяния показано, что агрегаты SDS, формирующиеся вблизи макромолекулы BSA, меньше, чем мицеллы8SDS в водном растворе.
Анализ данных ЯМР с использованием двух дейтерированных образцов SDS позволил установить, что макромолекула взаимодействует,в основном, с полярными группами мицелл SDS.Рис. 1. Взаимодействие SDS с BSA с образованием агрегата типа «жемчужного ожерелья» [9].Изучение структуры ассоциатов BSA с SDS, бромидом гексадецилтриметиламмония (CTAB) и додециловым эфиром октаэтиленгликоля С12Е8, а также лизоцима (Lz) с SDS с использованием флюоресцентной пробы показало, что модель ожерелья подходит для систем BSA – ПАВ и весьма ограничена для системыLz – SDS [10].
Наличие четырех дисульфидных мостиков обеспечивает структурную устойчивость глобулы Lz; разворачивания макромолекулы не происходит.Число кластеров ПАВ на полипептидной цепи составляет 2 – 4 для системы BSA– SDS и 1 для смеси Lz – SDS. Размер мицелл SDS, образующихся на цепи BSA,увеличивается с ростом концентрации ПАВ, после достижения ККМ происходитмицеллообразование в растворе [11].В [12] полагают, что в системе Lz – SDS образуется комплекс, представляющий собой разбухшую мицеллу с белком в нативной и частично развернутойформах, расположенным вблизи оболочки мицеллы (рис.
2). Лизоцим, благодарясвоему малому размеру, встраивается в мицеллу SDS, но не входит внутрь ядрамицеллы из-за своей гидрофильности.9Рис. 2. Структура комплекса лизоцим – SDS [12].С помощью методов криоэлектронной микроскопии, малоуглового рассеяния Х-лучей и нейтронов, динамического светорассеяния было показано, что примолекулярной массе белка меньше 20 кДа формируются комплексы белка с одноймицеллой ПАВ [13 – 15].В [16] было установлено, что при взаимодействии SDS с полипептидом между атомами кислорода в SO4-группе SDS и атомом водорода в аминогруппе полипептида образуются водородные связи, что приводит к образованию агрегатовпо типу «гибкой спирали» (рис.
3). При этом ПАВ формирует гибкую цилиндрическую мицеллу, вокруг которой по спирали оборачивается полипептид.Рис. 3. Структура комплекса полипептид – SDS [16].В работах [17, 18] отмечается, что при добавлении ПАВ к раствору белкавначале формируется гидрофобный комплекс вследствие взаимодействия полярных групп белка и ПАВ. При этом углеводородные цепи ПАВ обращены в сторону раствора. При увеличении концентрации ПАВ происходит связывание по гидрофобному механизму и образование гидрофильного комплекса. При этом глобула белка остается компактной.10Рис. 4. Формирование гидрофобного и гидрофильного комплексов в водном растворе смесейбелок – ПАВ [17].При добавлении к раствору белка противоположно заряженного ПАВ приопределенной концентрации белка и соотношения компонентов, в системе наблюдается формирование осадка [14, 19 – 22].
В работе [19] исследовано образование и растворение осадка в бинарном растворе Lz и октилсульфата натрия(SOS). Белок и ПАВ формируют комплекс стехиометрией Lz(OS)8, выпадающий восадок. С ростом общей концентрации раствора в избытке ПАВ образуются комплексы с 28 и 30 октасульфатными фрагментами на 1 молекулу лизоцима. Полагают, что начальный комплекс формируется за счет электростатических взаимодействий, после чего между ПАВ и комплексом наблюдается отталкивание.
Сростом концентрации ПАВ происходит растворение комплекса, вызванное индуцированным белком мицеллообразованием при критической концентрации ассоциации (ККА), равной 74 мМ. Выше ККА образуется гель. Считают, что при высокой концентрации ПАВ происходит неспецифическое кооперативное связывание с белком (процесс, аналогичный мицеллообразованию).В работе [20] отмечают, что при концентрации Lz свыше 0,1% его взаимодействие с SDS приводит к образованию осадка вследствие нейтрализации положительного заряда белка при взаимодействии с поверхностно-активными анионами.
При нейтральных рН поверхность глобулы Lz содержит 8 положительных зарядов. При увеличении концентрации ПАВ, когда соотношение SDS:Lz достигает19:1, происходит полное растворение осадка. При концентрации белка от 7 до20% образуется изотропный голубой прозрачный вязкий гель из частично денатурированных молекул лизоцима, соединенных мицеллами ПАВ.
Авторами работы[14] установлено, что структурной единицей геля являются агрегаты радиусом114,5 – 5,5 нм из 8 молекул Lz и ПАВ. Эти агрегаты соединяются в нитеобразныеструктуры, которые формируют сетку геля.В работе [23] представлена экспериментально полученная фазовая диаграмма системы Lz – SDS – вода, дополненная теоретическими расчетами, учитывающими электростатические и гидрофобные взаимодействия. Взаимодействиепо полярным группам белка и ПАВ приводит к образованию нейтрального гидрофобного комплекса, который выпадает в осадок. С увеличением концентрацииПАВ анионы додецилсульфата связываются с нейтральным комплексом за счетгидрофобных взаимодействий, увеличивая его заряд.
При этом вода и противоионы встраиваются в структуру осадка, вызывая набухание, однако, гидрофобныесвязи достаточно сильны, и осадок не растворяется. При увеличении концентрации SDS выше ККМ происходит полное растворение осадка. В работах [24, 25]образования и растворение осадка Lz – SDS описано с использованием ряда термодинамических параметров, измеренных методом изотермического калориметрического титрования.Как правило, изучение смесей белок – ПАВ проводят в фосфатном буферном растворе при pH близких к 7 и низкой ионной силе раствора. Изменение pHсреды влияет на образование осадка в системе белок – ПАВ, что связано с изменением поверхностного заряда белковой глобулы. Изоэлектрическая точка лизоцима pI = 11, при pH 3 и 4, когда белок заряжен положительно, наблюдалось помутнение раствора и выпадение осадка в системе Lz – SDS.
При pH 11 и 13, когдабелок не заряжен или заряжен отрицательно, помутнение раствора происходит взначительно меньшей степени [26]. Полагают, что при высоких рН белок и ПАВмогут связываться исключительно за счет гидрофобных взаимодействий. Изучение изменений во вторичной и третичной структуре белка методом круговогодихроизма показало наличие переходных состояний между компактным гидрофобным комплексом Lz – SDS и комплексом с развернутой белковой глобулой,полученным в результате гидрофобного связывания. Установлено образованиепереходного состояния в виде фибрилл. Добавки циклодекстрина препятствуютсвязыванию Lz с SDS и формированию осадка [27].
Выпадение осадка в системах12овальбумин – SDS и кональбумин – SDS также происходило при pH ниже изоэлектрической точки белков. Число молей SDS, приходящихся на моль белка восадке, зависело от pH раствора и увеличивалось с увеличением заряда белка.Осадок полностью растворялся при pH выше изоэлектрической точки. Увеличение температуры усиливает образование осадка и денатурацию белка.При изучении взаимодействия Lz с шестью анионными ПАВ установлено,что взаимодействия с алкилсульфатами натрия сильнее, чем с алкилсульфонатаминатрия при одинаковой длине алкильной цепи [21].
Взаимодействия анионныхПАВ с Lz усиливаются при удлинении алкильной цепи (для ПАВ с одинаковымиполярными группами). В работе [22] методами кругового дихроизма, флюоресценции, УФ спектроскопии, динамического светорассеяния, поверхностной тензиометрии и турбидиметрии установлено, что осадок, образованный при взаимодействии Lz с анионными ПАВ при нейтральном pH, растворяется при последующем добавлении катионных ПАВ.
При этом белок самопроизвольно сворачивается с восстановлением нативной структуры. Причина такого поведения состоит в образовании смешанных мицелл из анионных и катионных ПАВ, что является более выгодным процессом по сравнению с формированием комплексов белок – ПАВ.Конкурентные взаимодействия между противоположно заряженными ПАВи белком исследованы в работе [28]. Представлена фазовая диаграмма смеси SDSи хлорида додецилтриметиламмония в отсутствие и в присутствии Lz. При добавлении SDS к раствору Lz, как уже отмечалось, формируется осадок, который растворяется при добавлении как анионного, так и катионного ПАВ. Установлено,что при добавлении катионного ПАВ с додецильной цепью, SDS предпочтительноагрегирует с катионным ПАВ, а не с белком.
При добавлении катионных ПАВ сдецильной и октильной цепью, растворение комплекса анионного ПАВ с белкомпроисходит только в большом избытке катионного ПАВ.Ассоциация ПАВ с белками напрямую доказывается изотермами связывания, которые можно получить методами равновесного диализа с использованиемПАВ-селективных электродов и другими методами [1, 2, 9, 29]. Изотермы связы-13вания характеризуются комбинацией слабого некооперативного связывания в области низких концентраций ПАВ и интенсивного кооперативного связывания приболее высоких концентрациях ПАВ (рис. 5).Рис.