Исследование структуры гумусовых кислот методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, страница 11

Так, в 13С спектре ГФК не представляется возможным разделитьсигналы незамещенных и С-замещенных атомов углерода в ароматической области ввидуих сильного перекрывания. Однако, как видно из спектра QUAT, возможно с достаточнойточностью разделить сигналы С- и О-замещенных ароматических фрагментов. В области48-90 м.д.13С спектра, соответствующей сигналам гетерозамещенных алифатическихатомов углерода, раздельное интегрирование сигналов метильных, метиленовых иметиновыхфрагментов,предлагаемоерядомавторов[69],представляетсянеобоснованным в связи с довольно существенным перекрыванием. В области спектра 048 м.д. наложение сигналов метильных и метиленовых фрагментов делает их раздельноеинтегрирование невозможным.59В подспектрах препаратов HTL, HTO, и FMX8 наблюдаются те же самые сигналы,что дает основания предполагать качественное сходство фрагментного состава ГФКразличного происхождения.2.2.3.

Двумерные спектры ЯМРКак было показано выше, применение одномерной спектроскопии ЯМР дляиследования структуры ГФК основано на выделении групп сигналов атомов сходногоструктурного типа. Это не дает возможности охарактеризовать детальные различия междуатомами, входящими в такие группы, и во многих случаях не позволяет дать однозначноеотнесение сигналов из-за их сильного перекрывания. Использование двумернойспектроскопии ЯМР, основанной на регистрации попарных взаимодействий междумагнитными ядрами, открывает возможности для проведения такого анализа. Можновыделить два важных типа взаимодействий в спиновых системах: скалярное спинспиновое взаимодействие, передающееся через химические связи при помощи валентныхэлектронов, и передающееся через пространство диполь-дипольное взаимодействие.

Обатипа взаимодействий могут быть использованы для получения двумерных спектров.Основой двумерной ЯМР спектроскопии является введение второй частотнойпеременной и регистрация набора спектров в зависимости от изменения последней.Информацияовзаимодействиичерезэлектроныхимическихсвязейотражаетпоследовательность соединения атомов в молекуле. Диполь-дипольное взаимодействиевызывает перенос поляризации между пространственно близкими атомами благодаряядерному эффекту Оверхаузера, предоставляя информацию о пространственном строениимолекул [149].АнализдвумерныхЯМР-спектровпомогаетприинтерпретациисложныходномерных спектров ГФК.

С другой стороны, двумерные ЯМР спектры позволяютосуществить более детальную качественную характеристику фрагментного состава ГФК.Однако получение количественных данных из двумерных спектров таких сложныхсоединений на настоящий момент является практически неразрешимой задачей.Двумерная ЯМР спектроскопия широко применяется для анализа биологическихобъектов, однако использованию этого метода для исследования ГФК посвящены лишьединичные работы [149, 150].ВбольшинстведвумерныхЯМРэкспериментовпроводитсяустановлениекорреляции химического сдвига одного ядра с химическим сдвигом другого благодаряспин-спиновомувзаимодействиюмеждуними.Описанополучениегетероядерных 1Н-13С и гомоядерных 1Н-1Н двумерных спектров ГФК.двумерных60Двумерные 1Н-13С HMQC спектры ГФКДвумерная спектроскопия 1Н-13С HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation)позволяет получать корреляционные сигналы непосредственно связанных ядер 1Н-13С.Типичный спектр HMQC, полученный для препарата FA3, приведен на рис.

2.3.Отнесение сигналов в 1Н-13С HMQC спектре приведено в табл. 2.3.Полученные данные потверждают отнесения, сделанные при рассмотренииподспектров DEPT.Кроме того, на основании 1Н-13С HMQC спектров было дано отнесение сигналов вобласти 90-108 м.д. в13С спектре, в которой, как было показано при рассмотренииподспектров DEPT, наблюдаются сигналы СН фрагментов.

Наличие корреляционногопика 102/5.1 свидетельствует о том, что данные сигналы относятся к ацетальным атомамуглерода СO-Alk-O. В литературе имеются и другое мнение по поводу отнесения этихсигналов - в частности, эти сигналы относят к незамещенным атомам углеродаароматического кольца в орто-положении к которым находятся два ОН-заместителя.Однако отсутствие корреляционных пиков между сигналами13С ядер в области 90-108м.д. и ароматических протонов (6.5-8.5 м.д.) противоречит такому отнесению.Рис. 2.3.

Двумерный 1Н-13С HMQC спектр препарата FA3.61Таблица 2.3.113Отнесение корреляционных пиков в Н- С ЯМР спектрах ГК почв.Химический сдвиг113НС0.710, 15181.51.2-2.42217-4017-423.73.74.25.16.65864541031187.2130ОтнесениеСН3-группы, связанные с СН2- и СН-фрагментамиалкильных радикаловСН3-группы,связанныесСН-фрагментамиалициклических структурСН3-группы, связанные с ароматическим кольцомСН2-группы алкильных радикаловГруппа неразрешенных сигналов СНn-групп в α, β и γположенияхкароматическимикарбоксильнымзаместителямСН3-О группыСН2-ОН группыГетерозамещенные СНn-группы в аминокислотахАцетальные фрагменты циклических полисахаридовАроматические СН группы в орто-положении ккислородному заместителюПрочие ароматические СН группыСледует отметить, что в алифатической области спектра пик, соответствующийполиметиленовым цепям (28/1.2) не имеет высокой интенсивности.

Это можетсвидетельствовать о нехарактерности для структуры ГФК длинноцепочечных алкильныхмостиков, существование которых предполагалось в работе [60].Двумерные HMQC спектры, полученные для препаратов FA3, НTL, HTO и FA1,оказались практически идентичны. Это показывает единство фрагментного состава ГФКразличного происхождения.Двумерные 1Н-1H COSY и TOCSY спектры ГФКГомоядерные двумерные спектры 1Н-1H COSY (Correlation spectroscopy) позволяютполучить корреляционные пики от пар ядер1Н, разделенных двумя или тремяхимическими связями. Для регистрации 1Н-1H COSY спектров существенно, чтобыконстанта спин-спинового взаимодействия (КССВ) коррелирующих ядер была не меньшеспектральной ширины линии их сигналов.

Вследствие замедленного молекулярногодвижения молекул ГФК ширина спектральных линий протонов, как правило, велика, чтоограничивает применение данного метода для исследования структуры ГФК. Типичныйспектр COSY препарата FA3 приведен на рис. 2.4.В спектрах 1Н-1Н COSY наблюдается корреляционный пик 1.4/2.2 м.д., характерныйдля алифатических CH(1-2) фрагментов в α- и β-положениях к ароматическому кольцу или62карбоксильной группе. Это подтверждает данные о том, что в молекулах ГФКалифатические структуры присутствуют в виде мостиков, соединяющих ароматическиефрагменты структуры.

Корреляционные пики при 3.2/3.9 м.д., были отнесены к O-(CH–)CH2-OH фрагментам циклических полисахаридов. Корреляционный сигнал 1/3.5 м.д., повидимлму, относится к метильным группам, входящим в состав полипептидныхфрагментов.Метод 1Н-1Н TOCSY (Total correlation spectroscopy) основан на изотропном переносесинхронизированной по фазе намагниченности ядер в течение периода смешивания. Присоответствующем подборе времени смешивания возможно получать корреляционныесигналы достаточно удаленных (на 3-5 химических связей) ядер. Для больших молекулГФК данный метод дает определенные преимущества по сравнению с CОSY, не будучисвязан с величиной КССВ. Типичный спектр TOCSY, полученный для препарата FA3,приведен на рис. 2.5.Рис.

2.4. Двумерный 1Н-1Н СOSY спектр препарата FA3.63Рис. 2.5. Двумерный 1Н-1Н TOCSY спектр препарата FA3.В спектре1Н-1Н TOCSY наблюдаются большое количество корреляционныхсигналов полисахаридных структур в области 3.3-4.3 м.д. Ряд корреляционных пиков4.3/(1.2-2.3) м.д., по нашему мнению, обусловленпреимущественно сигналамиполипептидных фрагментов. Помимо этого часть сигналов в данной области можетотноситьсякCHnфрагментамвα-положениикароматическомукольцуигетерозамещенному алифатическому фрагменту. Алифатические протоны в α-положениик ароматическому кольцу, взаимодействуя с более удаленными протонами незамещеннойалкильной цепи, дают корреляционные сигналы при 2.3/(2.1-1.5).***На основании анализа вышеприведенных качественнеых ЯМР спектров былопределен набор структурных фрагментов, образующих молекулы ГФК.

Как ужеуказывалось в главе 2.1, в связи с низким содержанием азота и серы в структуре ГФК,фрагменты, содержащие указанные элементы не учитывались отдельно при рассмотрениифрагментного состава.В качестве основных структурных фрагментов ГФК были выбраны карбонильные(СC=O), карбоксильные/сложноэфирные группы (СCOOH(R)); атомы углерода ароматическихколец с соответствующими заместителями: незамещенные (СAr-H), С-замещенные (СAr-C),64связанные с гидроксильной/алкоксильной (СAr-OH(R)) группами; ацетальные (CO-Alk-O)фрагменты,вторичные(СCH-OH)ипервичные(СCH2-OH)кислородзамещенныеалифатические фрагменты, метоксильные группы (СOCH3) и алифатические фрагменты, несвязанные с гетероатомами (CAlk).Такой фрагментный состав в целом согласуется с литературными данными,полученными независимыми методами [8, 12].Указанный фрагментный состав характерен для ГФК всех исследованныхприродных источников, при этом различия наблюдаются лишь в относительномсодержании структурных фрагментов.

В связи с этим нами было предпринятоисследование структуры ГФК методами количественной спектроскопии на ядрах 13С и 1Н.652.3. Исследование структуры ГФК методом количественной13С ЯМР спектроскопии2.3.1. Условия регистрации количественных 13С спектров ЯМР ГФККак уже указывалось в главе 1, одна из основных проблем регистрации13количественныхС ЯМР спектров ГФК заключается в необходимости корректноговыбора условий, позволяющих исключить насыщение и ядерный эффект Оверхаузера.ВлияниеядерногоэффектаОверхаузеранаколичественностьполучаемойинформации было оценено при помощи регистрации спектра препарата HBW при полномотсутствии ядерного эффекта Оверхаузера (без развязки от протонов) и сопоставления егосо спектром, полученным в рекомендуемых в литературе условиях (генератор развязкивключен при считывании сигнала и выключен на период релаксационной задержки,импульсная последовательность INVGATE).

При сопоставлении этих спектров не быловыявлено различий в интенсивностях всех спектральных областей. Полученные данныесвидетельствуют,чтоиспользованиеимпульснойпоследовательностиINVGATEпозволяет полностью устранить влияние ядерного эффекта Оверхаузера.На сегодняшний день не существует единого мнения о величине релаксационнойзадержки (Td,), достаточной для получения количественных спектров. Это связано сотсутствием информации о времени релаксации Т1 ядер13С в различных структурныхфрагментах ГФК. Рекомендуемые в литературе величины Td составляют от 0.5 до 10 иболее секунд.

В связи с этим на первом этапе работы были проведены эксперименты пооценке необходимого времени релаксационной задержки. Для этого были полученыспектры 12 препаратов ГФК различного происхождения с задержкой между импульсами1, 2, 3, 4 и 8 с. Спектры интегрировали и для каждой спектральной области рассчитывалиизменения относительной интенсивности (IT) по отношению к таковой для спектра сTd = 1. Такое представление данных позволяет обобщить изменения, происходящие вспектрах различных препаратов ГФК при увеличении Td.На рис. 2.6 показаны изменения интегральных интенсивностей спектральныхобластей при увеличении времени задержки.

Результаты интегрирования спектровприведены в Приложении 2.66IT /I11.5СC=O1.3СCOOH(R)CAr-O1.1CAr-H,CCO-Alk-OCAlk-OCAlk0.90.7Td, s0.512Рис. 2.6. Зависимость34относительной567интегральной8интенсивностисигналаразличных спектральных областей от времени задержки (приведенывеличины, усредненные для 12 препаратов различного происхождения).Как видно из рис.