Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 7

coli,иммобилизованного через авидин-биотиновые взаимодействия на 6%-е агарозные частицы.Было показано, что иммобилизованный и свободный гибридные белки не различались потермостабильности; оба сохранили около 90% активности после инкубации при 4°C и 25°C втечение 22 ч, однако инкубация при 37°C в течение 22 ч привела к значительной потереактивности.

Иммобилизация не повлияла на величину Km, однако привела к трехкратномууменьшению величины kkat.В Таблице 4 приведены примеры гибридных белков биотинилированной люциферазы,системы экспрессии и их некоторые свойства.Таблица 4. Гибридные белки биотинилированной люциферазыСостав гибридного белкаИсточник Специфичеслюцифера кий домензыПлазмида, штаммпродуцент, способхроматографической очисткиL.

lateralis MAFSLRSILE pHLf203-bccp-LucAGKMELRN E.coli JM101TPGGSанионообменнаяL. lateralis bccppHLf248-Luc-bccpE.coli JM101анионообменнаяL. lateralis MAFSLRSILE pETNHis-BAP-LucAGKMELRN E.coli BL21 (DE3)TPGGSметаллохелатнаяP. pyralis bccppRSET-BCCP-LucE.coli BL21 (DE3)Свойства гибридного белка Ссылки(люциферазнаяактивность,содержание биотина, влияниеSA на биолюминесцентнуюактивность)95% исходной активности;[120]95% биотинилировано;80% в присутствии SA83% исходной активности[120]95% биотинилировано;SA не влияет на активностьНет данных[24]55-58% биотинилировано,42% в присутствии SA[118]металлохелатнаябиотинpET-His-KPBT-Luc Нет данных[114]связывающий E.coli BL21 (DE3)домен KPBTметаллохелатнаяCypridina SGLNDIFEAНет данныхНет данных[122]noctilucaQKIEWHE(avitag)Обозначения: bccp - биотин-связывающий домен ацетил-CoA карбоксилазы клеток E.

coli;KPBT- Klebsiella pneumoniae oxaloacetate decarboxylaseP. pyralis29Таким образом, использование биотин связывающих доменов открывают возможностиполучения биотинилированной люциферазы in vivo с сохранением высокого уровнябиолюминесцентной активности и стабильности люциферазы. В системах на основе биотинстрептавидиновых взаимодействий в основном используются биотинилированные компоненты,что приводит к необходимости использования биотинилированной люциферазы в составенековалентного комплекса со стрептавидином. Это требует дополнительного введениястрептавидина, что приводит к экономическим затратам, а также к необходимости оптимизацииполучения стабильного комплекса люцифераза-стрептавидин.

В настоящее время стабильныйкомплекс биотинилированной люциферазы со стрептавидином получен японской фирмойКиккоман на основе биотинилированной люциферазы L. lateralis, получение которойзапатентовано [123] и, как следствие, доступность данного комплекса для использования весьмаограничена.Гибридные белки люцифераза – антитела. Получение аналитического реагента дляиммуноанализа на основе люциферазы связано с получением комплекса антитело-люцифераза.Описанные выше гибридные белки люциферазы с белком А, биотин-связывающим доменом,стрептавидином позволяют получать сложный нековалентный комплекс с антителами внесколько стадий, и порой его стабильность зависит от условий и выбора участников этогокомплексообразования, что оказывает влияние на чувствительность метода.

Гибридные белки, вкоторых люцифераза ковалентно связана с антителами, позволяют избежать многостадийностипроцедуры проведения биоанализа на их основе, однако данный метод позволяет получатьгибриды только с рекомбинантными антителами, точнее их фрагментами, а для каждогоантитела требуется создание своей плазмиды. Данный тип гибридных белков пока не нашелширокого распространения для люцифераз светляков. Первый гибридный белок был получен1997 году для люциферазы P. pyralis с одноцепочечными антителами scFv к Ff1 субъединицегемоцианинаскорпионовAndroctonusaustralisсоставаVH-(Gly4Ser)3-VL-линкер(16аминокислот)-Luc [124], в данной работе был проведен поиск оптимального штаммапродуцента, среди HB2151, XL1 Blue, Topp 1 и Topp3 штамм Topp1 оказался оптимальным.Полученный гибридный белок обладал бифункциональной активностью - в присутствииантигена наблюдалось ингибирование биолюминесцентной активности.

В качестве примерагибридных белков фрагментов антител с другими люциферазами можно привести гибридныебелки на основе люцифераз Renilla [125] и Gaussia [126], [127] с димеризованнымифрагментами вариабельных участков антител (scFv, диабоди) к карциноэмбриональномуантигену (CEA), которые успешно были использованы для имиджинга опухолей in vivo.Помимо имиджинга подобные гибридные белки могут быть использованы в системах спереносом энергии, основные принципы которого описаны ниже. Так для Renilla люциферазы30был получен гибридный белок с фрагментами антител: тяжелыми цепями вариабельныхучастков антител, для улучшения растворимости гибридных белков в цитоплазме клеток E. coli.в структуру гибридов был добавлен домен тиоредоксина.

В данной работе были использованывекторные конструкции на основе системы pET под контролем T7 промотора, наработку белкапроводили в клетках E. coli, который затем очищали методом металлохелатной хроматографии[128]. Уровень экспрессии был невысок, всего 0,4 мг/1,5 литр клеточной культуры для Trx-VH–Rluc, однако люминесцентная активность полностью сохранялась.Гибридные белки для связывания с ДНК или РНК. Помимо иммуноанализа гибридныебелки на основе люцифераз используются для гибридизационного анализа ДНК или РНК. Дляэтого в состав гибридного белка добавляют белковый фрагмент, способный узнаватьопределенные последовательности ДНК/РНК.

Примеры таких белков: люцифераза - ДНКсвязывающий белок (ssb, Sp1, Zif268), люцифераза - РНК-связывающий белок (Таблица 5).В работе [129] 1995 года для детекции РНК был сконструирован гибридный белок T7tagD12H-Luc на основе люциферазы светляков с минимальным РНК-связывающим белком D12Hклеток HeLa, распознающим rH4 последовательность (UUAGGG) 4. Экспрессию гибридногобелка проводили в клетках E. coli BL21 (DE3) с использованием векторной системы pET.

Дляупрощения выделения и очистки использовали глутатион S-метил трансферазу (GST), которуюпосле аффинной хроматографии отщепляли. Недостатком данной экспрессионной конструкцииявлялась сложная система очистки гибридного белка, которую проводили в несколько стадий:аффинная хроматография, ионообменная хроматография, гель-фильтрация [129].Аналогичный подход был использован в работе 2012 года [58] для получениягибридного белка люциферазы светляков L. lateralis с ДНК-связывающим белком. В качествеДНК-связывающего белка были использованы различные варианты транскрипционныхфакторов,содержащихраспознающиедомендвухцепочечныеGCGTGGGCG-3′[57]и«цинковыепальцы»:последовательности5′-GTAAATGAT-3′[56]Sp1,ДНКZif268,B2,специфически5′-GGGGCGGGG-3,соответственноДля5′-увеличениярастворимости гибридного белка и возможности использования аффинной хроматографии дляего очистки на N-конец гибридного белка была добавлена, как и в работе [129] глутатион Sметил трансфераза (GST).

Экспрессию гена гибридного белка проводили в клетках E. coli BL21(DE3), однако выход белка был невысок, а люциферазная активность гибридного белкасоставила всего 10%. Несмотря на существенное снижение люциферазной активности,полученный гибридный белок все же позволял селективно определять бактериальный геном[58]. В следующей работе для увеличения выхода гибридного белка и люциферазнойактивности была создана плазмида на основе той же векторной системы, кодирующая Luc31Zif268 в виде гибридного белка со стрептавидином, при этом люциферазная активностьсоставила около 55 % от исходной [56]. Более удачный вариант гибридного белка люциферазысветляков с ДНК-связывающим белком (His6-SSB-Luc) был предложен японскими учеными сиспользованием той же экспрессионной системы и штамма-продуцента.

В качестве ДНКсвязывающего белка был использован домен, способный связываться с одноцепочечной ДНК,выделенный из клеток E. coli штамма JM109, к которому на N-конце была добавлена His6последовательность, обеспечивающая простой способ очистки белка методом металлохелатнойхроматографии. При этом люциферазная активность гибридного белка полностью сохранялась,а SSB-домен проявлял специфическую активность [91].Таблица 5. Гибридные белки на основе люциферазы светляков, способные связывать ДНКГибридныйбелокGST-Zif268– LucGST-Sp1– LucGST- B2– LucSA- Zif268– LucHis6-SSB-LucЭкспрессионнаясистемаpGEX, E.

coli BL21(DE3)pGEX, E. coli BL21(DE3)pGEX, E. coli BL21(DE3)pGEX, E. coli BL21(DE3)pET-His-SSB-Luc, E.coli BL21 (DE3)Метод очисткигибридного белкааффиннаяхроматографияаффиннаяхроматографияаффиннаяхроматографияаффиннаяхроматографияметаллохелатнаяхроматографияЛюциферазнаяактивностьСсылка10%[58, 59]10%[58]7,5%[56]55 %[56]100%[91]2.3. Применение конъюгатов и гибридных белков на основелюциферазы светляков в биоспецифическом анализеСреди большого количества возможных применений конъюгатов и гибридных белков наосновелюциферазоснованныйнанаиболеереакциивостребованнымнаправлениемвзаимодействия антиген-антитело,являетсяиммуноанализ,позволяющийсвысокойчувствительностью и селективностью проводить детекцию физиологически активных веществ.Быстрота, возможность автоматизации и высокая пропускная способность проведения анализа– открывают возможности его применения в клинических, фармакологических областях, вособенности в иммуногистохимии для чувствительной и специфической локализации аналита вотдельных участках тканей или клетках.Преимущество биолюминесцентного метода детекции иммунокомплексов заключается вболее высокой чувствительности регистрации биолюминесцентной метки по сравнению сколориметрическим методом детекции на основе пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и32хемилюминесцентным метода детекции вследствие низкого квантового выхода (0,01)хемилюминесцентной реакции [130].По способу регистрации метки можно выделить следующие основные типы систем:1) Системы, в которых происходит фиксация люциферазы на поверхности мишени,послечегообразовавшийсяспецифическийкомплексотделяется,идетектируетсябиолюминесцентный сигнал.

К таким системам в основном относится гетерогенныйиммуноанализ [131-135].2) Системы на основе резонансного переноса энергии, в которых специфическиевзаимодействия приводят к изменению спектра люминесценции (тушение, появлениедополнительной полосы в области испускания акцептора) [55].3) Системы, в которых под действием аналита изменяется реакционная способностьлюциферазы. Это могут быть системы, на основе гибридных белков/конъюгатов, в составекоторых люцифераза находится в неактивном состоянии, а в присутствии аналита происходитрасщепление гибридного белка или конформационные изменения, в результате которыхлюциферазная активность восстанавливается, либо наоборот, что встречается гораздо реже, вприсутствии аналита активность люциферазы уменьшается [92]. Второй вариант таких систем –сплит-системы, в которых изначально люцифераза разделена на две части таким образом, что вотсутствие аналита биолюминесцентная реакция не протекает.