Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 6

При этом выбор белковых доменов ограничен ихсвойствами и выбором экспрессионной системы, пригодной для их наработки в комплексе слюциферазой, поэтому часто получают гибридные белки люцифераза - универсальныйбелковый домен специфичный к целому классу соединений:белок А [23, 85-88], белок G [89],ДНК-связывающий домен [57, 58, 90] и далее используют специфические антитела илифрагменты ДНК/РНК, в результате получается нековалентно связанный детектирующийкомплекслюцифераза-антитело/ДНК(РНК)связывающийдоменилилюцифераза-специфический олигонуклеотидный зонд [91].Несмотря на широкое распространение «универсальных гибридных белков», влитературе можно встретить отдельные работы по получению гибридных белков люциферазы сфрагментами антител и отдельными аналитами: рецептором эстрогена (с люциферазой Renilla)[92], различными пептидами: октапептид-обелин [93], белок С-акворин [94], Renilla-домен25гиалуронан-связывающего белка человека [95], акворин-ангиотензин (олигопептидный гормон)[96] и др.Также активно развивается новое направление по созданию гибридных белков для BRETанализа, содержащих расщепляемые специфическими протеазами линкеры [97, 98], гибридныхбелков на основе сплит люциферазы [99, 100], люциферазы с суперскрученными белковымифрагментами [101-103], а также гибридных белков, биолюминесцентный сигнал которыхзависит от конформационных изменений, индуцируемых аналитом [104].2.2.4.

Гибридные белки, полученные на основе люцифераз светляковГибридный белок люцифераза-белок А и люцифераза-белок G . Важнейшей составнойчастью белка А (28кДа), выделенного из стафилококка, служит домен, способный образовыватьсвязь с Fc-фрагментом IgG человека и мыши [86]. При его гибридизации с молекулойлюциферазыпоявляетсявозможностьполучениянековалентносвязанногокомплексалюцифераза-антитело.Гибридные белки люцифераза-белок А были получены сначала для бактериальнойлюциферазы Vibrio harveyi в 1991 г с сохранением 50% активности исходной люциферазы [88],а в 1993 г. и для люциферазы светляков L.

Lateralis [86]. Для L. Lateralis была получена сериягибридных белков на основе ее мутантных форм: с удаленным 12-м аминокислотным остатком,люциферазы без делеции [87] и термостабильной формы с заменой Glu/Lys 354 [85]. Гибридныебелки получали путем встраивания гена люциферазы в вектор pMALU, содержащий ген белкаА, который помещали на N-конец люциферазы. Белок, наработанный в клетках Е. coli штаммаJM109, отделяли при помощи аффинной хроматографии. Активность очищенного гибридногобелка для люциферазы с удаленным 12-м остатком составила 20% [23], при этом наблюдаласьочень низкая стабильность гибридного белка при очистке.

Аналогичный гибридный белок,полученный для люциферазы с возвращенным 12-м аминокислотным остатком, был так женестабилен при очистке, а его биолюминесцентная активность составила лишь 10% отактивности исходной люциферазы без белка А [87]. В работе [85] была получена улучшеннаямодификация гибридного белка, с использованием мутантной формы люциферазы с заменойGlu/Lys 354 , обладающей высокой термостабильностью и стабильностью при очистке, врезультате люциферазная активность гибридного белка была в 6 раз выше, чем у гибридногобелка без мутации. В работе [89] был получен гибридный белок: люцифераза-белок G,способный связываться с более широким спектром антител: Fc фрагментами антител мыши,кролика, козла, овцы. Преимущество данной конструкции заключалось в использованиивысокоэффективной экспрессионной системы pET и полигистидиновой последовательности,26помещенной на N-конец гибридного белка, которая позволяла использовать простой и быстрыйметод очистки белка с использованием металлохелатной хроматографии [89].Гибридные белки стрептавидин-люцифераза.

Гибридные белки со стрептавидиномполучены для некоторых люцифераз и фотопротеинов. Так гибридный белок акворинстрептавидин в клетках E.coli экспрессировался в виде телец включения, что требовалопроводить процедуру рефолдинга [105]. Нативные гибридные белки стрептавидина с зеленымфлуоресцентным белком [106] и люциферазой P. plagiophthalamus [107] были получены вклетках насекомых S.

Frugiperda с использованием экспрессионной системы бакуловируса. Вклетках E.coli были получены гибридные белки для зеленого флуоресцентного белка [108] илюциферазы светляков Luciola lateralis [109]. Однако отсутствие His6 в упомянутыхконструкциях значительно усложняло процедуру выделения и очистки гибридных белков.Гибридный белок люциферазы светляков со стрептавидином, содержащий His6, описан в статье[110], однако активность гибридного белка составляла всего 10% от активности исходнойлюциферазы, хотя кинетические характеристики гибридного белка сходны с люциферазойдикого типа [24, 111].

Известно, что стрептавидин образует тетрамеры, которые обладаютвысоким сродством к биотину [112], однако для полученных гибридных белков отсутствуютданные об их олигомерном составе, а это может быть важно для правильной интерпретациианалитических данных, полученных с использованием данных белков. Таким образом, можносделать вывод о том, что, по-видимому, получение стрептавидин-люциферазы сопряжено сосложностьюпроцессаегополучения,поэтомуширокоераспространениеполучилинековалентные комплексы биотинилированная люцифераза-стрептавидин, описанные ниже.Гибридные белки люцифераза-биотин.

Получение стрептавидин-люциферазы свысокой биолюминесцентной активностью возможно с использованием биотинилированнойлюциферазы в комплексе со стрептавидином. Для получения биотинилированной люциферазыгенноинженерным методом часто используется биотин-связывающий белковый фрагмент, вкачествекоторогоможетвыступатьлибобиотин-связывающийдоменацетил-CoAкарбоксилазы клеток E. coli [24] размером 87 а.к., транскарбоксилазы клеток Propionobacteriumshermanii [113] или оксалоацетат декарбоксилазы клеток Klebsiella pneumonia [114], либополученный методом молекулярного конструирования биотин-связывающий пептид [115, 116].В работе [116] проведен скрининг различных биотинсвязывающих пептидов.Методомгенетическойинженериигибридныемолекулылюцифераза-биотин-связывающий домен были получены для люциферазы светляков Photinus pyralis [117, 118] , иLuciola lateralis [119, 120], а также для люциферазы Cypridina noctiluca, модифицированнойкрасителем HiLyte Fluor™ 647 и фотопротеинов, например, акворина [113].

Биотинсвязывающие домены или пептиды клеток E.coli добавляли как на N-, так и на C-концы27люциферазы:bccp-84[120]иbccp-87[117-120]соответственно.Вработе[114]биотинсвязывающий домен оксалоацетат декарбоксилазы Klebsiella pneumoniae добавлен на Nконец люциферазы.Для наработки гибридного белка клетки E.coli штамма JM101 (lac-pro) [119], JM109[113] либо BL21 (DE3) [24] были трансформированы полученными плазмидами. Очисткугибридных белков проводили либо с использованием аффинной хроматографии на колонке,покрытой мономерным стрептавидином (для акворина) [113], либо анионообменнуюхроматографию на гидроксиапатитовой колонке (для люциферазы L.

lateralis) [120]. В работах[24], [118], [114] для очистки использовали металлохелатную хроматографию, поскольку вструктуру белков были введены полигистидиновые последовательности.Процент биотинилирования гибридного белка варьировался в зависимости от условийэкспрессии и от природы люциферазы. Так для, люциферазы P. pyralis без добавления биотинав питательную среду процент биотинилирования составлял 55-58%, в присутствии биотина впитательной среде возрастал до 95% [118], в то время как гибридный белок на основелюциферазы L. lateralis степень биотинилирования составила 95 % без дополнительноговведения биотина в питательную среду [120].

Для акворина процент биотинилированиясоставлял всего 12%, и добавление биотина в питательную среду не увеличивало выходбиотинилированного белка. Для улучшения биотинилирования в плазмиду, кодирующуюгибридный белок акворин-биотинсвязывающий домен, был введен ген биотинлигазы, егокоэкспрессия увеличила процент биотинилирования белка до 85-95% [113].В случае люциферазы P. pyralis выход белка полученного трансформацией плазмидыpRSET-BCCP-Lucсоставил 9,1 мг с 200 мл клеточной культуры, что составило 72% отэкспрессируемого белка [118].

Для плазмиды pET-His-KPBT-Luc на основе той же люциферазывыход составил 8 мг с 250 мл среды [114]. Для гибридного белка на основе акворина выходсоставил всего 1 мг с 1000 мл среды, что объяснялось большим количеством телец включения.Былопоказано,чтодобавлениебиотин-связывающегодоменаневлияетнатермостабильность [118] и pH- стабильность люцифераз P. pyralis и L. lateralis при 50 °С и 37°С (2-е суток) [120].Полученные гибридные белки обладали высокой стабильностью при хранении.

Такбиолюминесцентная активность гибридного белка при хранении в течение 4 недель при -20 °С в50% глицерине составляла 93% [118], а для гибридного белка, описанного в работе [114],сохранялось 90% от исходной активности после хранения в течение недели при +4 °С.Для полученных гибридных белков было проанализировано влияние стрептавидина наих биолюминесцентную активность.

Так для гибридного белка на основе люциферазы P. pyralisсвязывание bccp-Luc со стрептавидином уменьшало его биолюминесцентную активность до2842% [118], в то время как для гибридного белка на основе люциферазы L. lateralis сиспользованием короткого биотинсвязывающего пептида биолюминесцентная активностьуменьшалась до 80 %, а для гибридного белка той же формы люциферазы, но с полным биотинсвязывающим доменом оставалась неизменной [120].В работе [121] было изучено влияние иммобилизации на свойства люциферазы P. pyralisв составе гибридного белка с биотинсвязывающим доменом, выделенным из E.