Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 5

При попытке конъюгации того же мутанта по NH2-группам стироксином с использованием в качестве сшивающего реагента глутарового альдегидаактивность фотопротеина уменьшилась в 10000 раз [66].По SH-группам проводили конъюгацию мутантов акворина, содержащих единственныйцистеин [64] и обелина, модифицированного иминотиоланом [62], с тироксином. При этомиспользовалигетеробифункциональныереагентыSulfo-GMBS(N-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимидный эфир) и SMCC (сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1карбоксилат) соответственно.

Люминесцентная активность фотопротеинов в составе гибридныхбелков полностью сохранялась. В первом случае получены конъюгаты состава 1:1, во второмслучае точный состав идентифицировать не удалось.Конъюгаты с биотином. Среди конъюгатов люцифераз и фотопротеинов снизкомолекулярными соединениями отдельно стоит отметить конъюгаты с биотином,используемыевсистемахнаосновевысокоаффинныхбиотин-стрептавидиновыхвзаимодействий.

Конъюгаты с биотином получают в основном по аминогруппам сиспользованиемлинкерами,биотина,либопоактивированногоSH-группамN-гидроксисукцинимидоммутантныхформбелковссразличнымииспользованиеммалеимидпроизводных производных биотина (Таблица 1) с различными линкерами.Стоит отметить, что проблема получения конъюгатов однородного составасиспользованием аминогрупп остается не решенной. Так, для акворина, молекула которогосодержит 16 доступных для реакции аминогрупп [72], был проведен поиск наиболеереакционноспособных остатков. Биотинилированный акворин, полученный с использованиемNHS-LC-биотина, который менее реакционноспособен, чем его сульфопроизводное был21проанализированметодоммасс-спектрометрии,однаковыявитьнаиболеереакционноспособные группы и получить конъюгаты однородного состава не удалось.

[72-74],.Поэтому в работе [68] был использован мутантный вариант акворина, позволяющий проводитьбиотинилирование по единственной доступной SH-группе, в результате чего был полученконъюгат с сохранением биолюминесцентной активности строго определенного состава,который был подтвержден методом масс-спектрометрии.Таблица 1. Конъюгаты люцифераз и фотопротеинов с биотиномБиолюминесцентныйбелокЛюциферазасветляков L. cruciateЛюциферазасветляков P. pyralisЛюциферазасветляков CypridinaАкворинГруппаЛигандБиолюминесцентнаяактивность конъюгата,%СсылкаNH2NHS-биотин1[52]NH2NHS-биотин100[75]NH2NHS-LC-биотин,NHS-PEO4-биотинTFP-PEO-биотинNH2NHS-LC-биотин28161.670~100[76][77][72]Малеимидноепроизводное PEO2~100[68]биотинаОбозначения: NHS-биотин – N- гидроксисукцинимидный эфир биотинил-ε-амино-капроновойкислоты,NHS-LC-биотин–сукцинимидил6-(биотинамидо)гексаноат,TFP–тетрафторфениловый эфир PEO- полиэтиленгликоль, Cys-акворин- мутантный вариантакворина, с активным цистеином, введенным мутагенезом.Cys-акворинSHДля люциферазы светляков L.

cruciate первые конъюгаты с биотином были получены в1992 году Arakawa с соавторами, однако процесс конъюгации был связан с существеннойпотерей активности люциферазы в составе конъюгата (Таблица 2)Таблица 2. Свойства конъюгатов люцифераза-биотинСостав конъюгата, молярноеотношение биотин:люцифераза вреакционной смеси00,93,718,737,4Биолюминесцентнаяактивность, %Ингибированиеавидином100,019,710,01,60,45,65,244,296,797,6Как показано в Таблице 2, конъюгат, полученный при молярном отношениилюцифераза:биотин в реакционной смеси 18,7, обладающий наилучшей способностьюсвязывать авидин, сохранял всего 1,6 % от активности исходной люциферазы.

Несмотря на это,22авторы показали возможность его использования в гомогенном иммуноанализе биотина, восновекотороголежалоингибированиебиолюминесцентнойактивностиконъюгата,добавление свободного биотина предотвращало ингибирование люциферазы в составеконъюгата. Диапазон определяемых концентраций составил 15-500 пг/лунка [52].В 2007 году [75] был создан и запатентован более успешный метод полученияконъюгатов люцифераза светляков-биотин по NH2-группам люциферазы с использованием 2,3диметил малеинового ангидрида, обратимо модифицирующего аминогруппы люциферазы [78]и предохраняющего аминогруппы активного центра от модификации в процессе конъюгации.Стоит отметить, что при использовании этого модифицирующего агента, количество групп,способных вступать в реакцию конъюгации уменьшается, что существенно снижаетэффективность конъюгации, однако способствует сохранению активности фермента.Конъюгатысбелками:стрептавидином,антителами.Распространеннымиреагентами для ИФА являются конъюгаты с белками, такими как стрептавидин, образующийвысокоаффинный комплекс с биотинилированными мишенями, и антитела, позволяющиеполучать простой специфический реагент для детекции заданного аналита.Известно большое количество работ по получению таких конъюгатов для различныхвариантов фотопротеинов, некоторые примеры приведены в Таблице 3.

Конъюгацию проводятпо -SH и -NH2 группам с использованием в основном гетеробифункционального реагентаSMCC и его более активного сульфо-производного. При этом используют термостабильныемутантные формы люцифераз/фотопротеинов или формы со специально введенными SHгруппами с использованием химической модификации -NH2 групп (NH2-> SH) или сайтнаправленным мутагенезом.В отличие от фотопротеинов, для люцифераз светляков описаны лишь единичныеработы по получению конъюгатов с антителами, и стрептавидином или его аналогом(авидином). Присутствие субстратов люциферазы в реакционной смеси во время конъюгацииспособствует стабилизации люциферазы и сохранению биолюминесцентной активности от 11%(в присутствии LH2) до 40% (в присутствии Mg2+ и ATP). Защита аминогрупп с использованиемDMMA способствует полному сохранению биолюминесцентной активности, но снижаетэффективность конъюгации.

Для термостабильной люциферазы L. mingrelica была показанавозможность конъюгации с антителами и авидином, модифицированными бифункциональнымсшивающим агентом SPDP по двум нативным поверхностным остаткам цистеина в позиции 62и 164, удаленным от активного центра. После проведения реакции конъюгации сохранилосьоколо 80% активности, однако, стоит отметить неоднородность состава полученныхконъюгатов - около 17% конъюгата составляют олигомерные продукты [79, 80].23Таблица 3. Примеры конъюгатов люцифераз и фотопротеинов с белками и их свойстваБиолюминесцентный белокАкворин +SATACys-акворинCys-акворинОбелин +2-иминотиоланЛюциферазаP. pyralisЛюциферазаP.

pyralis + 2иминотиоланЛюциферазаL. mingrelicaБелокБиолюминесцентнаяактивностьконъюгата, %СсылкаSulfo-SMCCSA50-60[81]SHSHSulfo-SMCCSulfo-SMCCSAAb к α-фетопротеинунет данныхнет данных[67][67]NH2-> SHSMCCAb к гормонам~100[62]NH2SMCCAb к рицину11-40[82,83]NH2-> SHsulfo SMCCAb к креатинкиназе~100[75]SHSPDPАвидин70-80[79]ГруппаСшивающийагентNH2-> SHантивидовые Ab,Ab к клеткам80[80]SalmonellaSMCCсукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклошексан-1-карбоксилат,SATANсукцинимидил S-ацетилацетат, SPDP- N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)-пропионат, Cysакворин- мутантный вариант акворина, с активным цистеином, введенным мутагенезом.ЛюциферазаL. mingrelicaNH2-> SHSPDPКонъюгаты с ДНК.

Помимо иммуноферментного анализа, фотопротеины и белкинаходят применение в гибридизационном анализе ДНК и РНК для определения идифференциации патогенных микроорганизмов. Для этих целей получают конъюгатыфотопротеиновс олигонуклеотидамисиспользованиемописанных вышеподходов.Олигонуклеотиды представляют собой либо последовательности, комплементарные целевойпоследовательности ДНК/РНК [63], либо универсальные поли dT последовательностикомплементарные промежуточному ДНК-зонду (аналог вторичных антивидовых антител) [81].Следует отметить, что подобные конъюгаты были успешно получены для акворина по NH2группам(сохранялось90-100%люминесцентнойактивности)[63,81]ипозволялидетектировать ДНК в диапазоне 0.3- 500 пМ [81] , или 2- 2000 пМ [63] в зависимости от схемыанализа и сшивающего агента.

Для люциферазы светляков (P. pyralis) высокоактивногоконъюгата с олигонуклеотидами получить не удалось, при попытке конъюгации по SH-группамс использованием 2-амино-6-винилпиридин нуклеозида сохранялось лишь 0,1 % активностиисходной люциферазы даже после обработки стабилизирующим агентом (ПЭГ-малеимидом)[84].24На основании проанализированных литературных данных можно сделать вывод, что,несмотря на большое разнообразие модифицирующих и сшивающих реагентов и возможностьполучения необходимых мутантных форм для стабилизации и введения необходимыхфункциональныхгруппвмолекулубелка,длялюциферазсветляковполучениебифункциональных молекул методом химической конъюгации не является характерным, иразработанные методики имеют свои ограничения.2.2.3. Методы генетической инженерии по созданию гибридных белков наоснове люциферазыАльтернативным способом получения бифункциональных молекул на основе люциферазявляетсягенноинженерныйметод.Сразвитиембиотехнологиисталидоступнырекомбинантные белки, экспрессируемые в бактериальных системах, что позволяет получать ихв неограниченных количествах, а также появилась возможность получать генноинженерныеконструкции, кодирующие аминокислотную последовательность белка-детектора с доменами,способными селективно связываться с различными мишенями.Преимущества такого подхода заключаются в: 1) постоянном стехиометрическомотношении люцифераза:целевой белок (обычно 1:1); 2) постоянной структуре гибридного белка(положение специфического домена относительно люциферазы); 3) возможности получениягибридного белка в неограниченных количествах путем экспрессии его гена, наработки вклетках бактерий и дальнейшей очистки; 4) отсутствии необходимости в дорогостоящиххимических реагентах; 5) лучшем сохранении биолюминесцентной активности люциферазы всоставе гибридного белка по сравнению с методами химической конъюгации.Ограничения данного метода заключаются в возможности получать экспрессионныевектора только для белковых молекул.