Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 4

Например, в работе [50] проба, отвечающая за иммобилизацию ДНК на поверхностипланшета содержала дигоксигенин (D) (Рис. 6), образующий специфический комплекс сантителами к дигоксигенину, а биотинилированная проба образовывала специфическийкомплекссбиотинилированнойДНК,кодирующейлюциферазупутембиотин-стрептавидиновых взаимодействий. Диапазон определяемых концентраций ДНК составил от 5до 5000 аттомоль. Данный подход позволяет проводить одновременное мультиплексноеопределение нескольких последовательностей ДНК-мишеней [51] с использованием двухрепортерных молекул, кодирующих люциферазу светляков и люциферазу Renilla, содержащиена концах разные специфические участки (биотин или поли dA последовательностьсоответственно) [51].Рис.

6. Схемы специфических комплексов для гибридизационного анализа нуклеиновыхкислот с использованием гена люциферазы светляков [50]Описанные выше методы основаны на использовании люциферазы без специфическихучастков, а селективность анализа обеспечивают другие компоненты, входящие в составаналитической системы. Получение гибридных молекул люциферазы со специфическимиучастками в течение длительного времени было весьма затруднительно вследствие еетермической нестабильности и инактивации при химической модификации, а также длительной17процедуры выделения и очистки белка, что существенно ограничивало области применениялюциферазы, особенно в качестве ферментативной метки в иммуноанализе [32, 52, 53].Возможность получениябифункциональных молекуллюцифераза-специфическийучасток появилась с развитием методов генной инженерии.

Были получены термостабильныемутантные формы люциферазы, экспрессионные системы, позволяющие получать фермент,содержащий в своем составе полигистидиновую последовательность, позволяющую проводитьбыструю очистку фермента в мягких условиях методом металлохелатной хроматографии и темсамым минимизировать инактивацию и потерю фермента/конъюгата в процессе очистки. Вряде работ были созданы мутантные формы люциферазы с добавленными или удаленнымихимически-активными группами, обеспечивающими минимальные потери биолюминесцентнойактивности фермента в процессе модификации и однородность состава полученныхконъюгатов.Такжеширокоераспространениеполучилиметодыгенетическогоконструирования по получению гибридных белков, позволяющие добавлять к молекулелюциферазы белковый фрагмент, способный связываться с определенной мишенью.Таким образом, стало доступно получение бифункциональных молекул, совмещающих всебе высокую чувствительность белка-детектора с высокой селективностью специфическогоучастка (белкового домена, пептида или небольшой органической молекулы), способногосвязываться с изучаемой мишенью.

Полученные таким способом гибридные белки и конъюгатылюциферазы используются в различных вариантах иммуноферментного анализа дляопределения самых разнообразных антигенов [54]; для изучения механизмов межбелковыхвзаимодействий при помощи биолюминесцентного резонансного переноса энергии [55];гибридизационном анализе нуклеиновых кислот [56-59] для поиска биомаркеров.Таким образом, в настоящее время актуальной задачей является создание новыхбиоаналитических высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов для определенияультранизких количеств различных физиологически активных веществ и патогенныхмикроорганизмов, изучения межмолекулярных взаимодействий.2.2. Методы получения бифункциональных молекул на основелюциферазы и фотопротеиновСреди методов получения бифункциональных молекул люцифераза-специфическаямолекула можно выделить химическую конъюгацию, сайт-направленную химическуюконъюгацию и экспрессию генноинженерных конструкций.182.2.1.

Методы химической конъюгации. Основные подходыХимические конъюгаты получают в основном по амино- или сульфогидрильнымгруппамбелковсиспользованиемсукцинимидныхималеимидныхпроизводныхконъюгируемых веществ, соответственно. Данный метод универсален благодаря большомуразнообразию сшивающих агентов, что позволяет выбрать функциональные группы, длину иподвижность линкера, растворитель для проведения реакции конъюгации. Особенно следуетотметить сульфопроизводные сшивающих агентов, обладающие лучшей растворимостью вводе и позволяющие избежать присутствия органической фазы во время проведенияконъюгации.Стоит отметить, что данный метод используется для конъюгации люцифераз как сбольшими молекулами, такими как белки, так и с пептидами, олигонуклеотидами инизкомолекулярными соединениями, такими как гормоны.

Полученные конъюгаты применяютдля любых видов традиционного иммуноанализа и анализа межмолекулярных взаимодействийна основе резонансного переноса энергии. Несмотря на свою «универсальность», данный методобладает рядомнедостатков: 1) снижение биолюминесцентной активности люциферазы всоставе конъюгата в случае большого количества реакционных групп, задействованных впроцессе конъюгации, 2) неоднородность состава конъюгата, 3) воспроизводимость зависит отмногих факторов, поэтому данный метод требует серьезной оптимизации.Направленная конъюгация, модификация аминогрупп. Для улучшения эффективностиконъюгации в ряде работ вводили дополнительную реакционноспособную сульфогидрильнуюгруппу путем модификации аминогрупп с использованием реагента Траута (2-иминотиолан).Данный подход применяют в двух случаях: 1) если химическая конъюгация белка поаминогруппам не оказывает существенного влияния на биолюминесцентную активность, амодификация–SHгрупп,например,N-этилмалеимидомсущественноингибируетбиолюминесцентную активность белка [60]; 2) для получения возможности использованиягетеробифункциональных сшивающих агентов.

Например, модифицированный таким образомакворин, конъюгировали с малеимид-активированным иммуноглобулином к тиреотропномугормону. Активность полученного в этом случае комплекса была на порядок выше, чем вслучае синтеза с использованием не тионилированного акворина [61]. Для обелина такойподход использовали при конъюгации с активированными малеимидом (sulfo-SMCC)аминогруппами антител. Полученный конъюгат позволил проводить как конкурентный длятироксина, так и сэндвич иммуноанализ для тиротропина с чувствительностью, сопоставимой срадиоиммуноанализом [62].19В работе [63] для введения дополнительной -SH группы в молекулу акворина авторыиспользовали другой тионилирующий агент – N-сукцинимидил S-ацетилтиоацетат (SАТА).Вводимая при этом тиогруппа защищена от преждевременного окисления ацетоэфирнойгруппировкой, которая отщепляется с помощью гидроксиламина. Полученный SH-аквориниспользовали для конъюгирования с малеимид-активированным стрептавидином.

Конъюгатстрептавидин-акворин является чувствительной универсальной меткой при обнаружениилюбых биотинилированных мишеней.Использованиемутантныхформ.Дляполученияконъюгатовсзаданнымстехиометрическим соотношением и минимизации инактивации метки в ходе реакцииконъюгации используют сайт-направленную химическую конъюгацию. Например, дляакворина в работе [64] был получен мутант, в котором сайт-направленным мутагенезом былизаменены все нативные остатки цистеина на серин и введен уникальный цистеин [65], покоторому происходило присоединение тиреоидного гормона тироксина, предварительномодифицированного малеимидной группой. В результате был синтезирован конъюгат акворинтироксин для гомогенного ИФА постоянного состава 1:1, предел обнаружения тироксинасоставил 10−12 М, что на 3 порядка ниже, чем для коммерчески доступных иммуносистем [66].

Встатье [67] описан мутантный вариант акворина, с активным цистеином, введенныммутагенезом, так называемый cys-акворин, и проведена его конъюгация с активированнымималеимидом (Sulfo-SMCC) антителами к α-фетопротеину, стрептавидином и биотином [68] безсущественной потери люминесцентной активности. В работе [68] для облегчения полученияконъюгатоввсоставакворинабыладополнительновведенаполигистидиноваяпоследовательность. Для люциферазы светляков подобное введение цистеинов было проведенов 2010 году Бранчини с соавторами. Несмотря на то, что люцифераза светляков Photinus pyralisсодержит четыре остатка цистеина, анализ структуры показал, что все они недоступны длярастворителя.

Для введения доступного для растворителя реакционноспособного цистеина наповерхности люциферазы были выбраны остатки Thr169, Ser185, Ser307, Phe368, Ser399 ипроведена их замена на Cys. Была получена и охарактеризована серия мутантов с единичнымизаменами, на основании которых был создан мутант RE10 с двойной заменой T169C и S399C,содержащий два активных цистеина. При этом замены не повлияли на биолюминесцентнуюактивность фермента, термостабильность и спектры люминесценции, а специфичность ксубстратам возросла в 1,4 раза.

Для RE10 была успешно проведена реакция конъюгации скрасителем, и полученный конъюгат был использован для последовательного резонансногопереноса, как описано ниже [69].202.2.2. Химически полученные конъюгаты на основе люцифераз и фотопротеиновКонъюгаты с гормонами и низкомолекулярными веществами. В литературепрактически не встречается работ по конъюгации люциферазы светляков с гормонами инизкомолекулярными веществами, такими как кортизол, тироксин, метилированный тироксин,дигоксин, поэтому ниже будут рассмотрены основные подходы, использованные в работах пополучению таких конъюгатов для фотопротеинов акворина и обелина. Так, для мутантнойформы акворина без цистеинов (мутант-S) была проведена конъюгация по NH2-группам сиспользованием N-гидроксисукцинимидных эфиров производного 3-O-карбоксиметилоксимакортизола [70] и 3-O-метилкарбонил-e-аминокапроновой кислоты дигоксина [71].

При этомлюминесцентная активность первого конъюгата составила 56% от активности исходногофотопротеина при соотношении фотопротеин:кортизол 1:250 в реакционной смеси, во второмслучае активности составили 90, 14, 3,5 % для конъюгатов состава фотопротеин:дигоксин 1:1,1:2, 1:4 соответственно.