Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 3

Таким образом, консервативный остатокLys531 обеспечивает правильную ориентацию и взаимодействие карбоксильной группылюциферина с ATP, стабилизируя переходное состояние (Рис. 3) в то время как множественныеконтакты между ATP и белковыми остатками N-домена (317-320, Ile436, Gly341, Gln340)объясняют абсолютную специфичность люциферазы по отношению к ATP [11]. За связываниеиона Mg2+ на первом этапе реакции отвечают консервативные остатки Ser200, Thr345 и Glu346[12].12Рис. 3. Активный центр люциферазы светляков L.

cruciata в присутствии DLSA – аналогапромежуточного продукта стадии аденилирования. Пунктиром обозначены водородные связи[8]Положение молекулы люциферина жестко фиксировано благодаря большому количествуостатков Gly (230, 248, 317, 318, 341), содержащихся на люциферин-связывающем участке [13].На второй стадии (окисление люциферина) происходит поворот C-домена дополнительно ~ на140° по сравнению с его расположением в комплексе люцифераза - LH2 - ATP. Справедливостьэтой модели была подтверждена экспериментами по замене ряда остатков с помощью сайт направленного мутагенеза. При этом было показано, что в то время как для протекания первойстадии реакции важную роль играет остаток Lys531, на стадии окисления его функциювыполняет Lys443, находящийся с противоположной стороны C-домена [14].

Тем самым,структура люциферазы обеспечивает ее абсолютную специфичность к субстратам.Таким образом, высокий квантовый выход биолюминесценции в люциферинлюциферазной системе светляков, высокая специфичность фермента к его субстратам(люциферину и ATP), легкость регистрации биолюминесцентного сигнала в видимой областиспектра обусловили широкое применение люциферазы светляков в различных вариантахбиоспецифического анализа, основанного на определении ее субстратов и реакций,сопровождающихся их образованием или деградацией в присутствии изучаемых аналитов, а13также самой люциферазы в качестве маркера, при исследовании многих биохимических имолекулярнобиологических процессов.2.1.1.

Применение люциферазы в методах анализа, основанных на детекции еесубстратов (АТP и люциферин)Методы «быстрой микробиологии». Это чувствительные, и универсальные методыдетекции бактерий на основе экспресс-определения ультрамалых количеств АТP в образце [15],которые находят применение для определения биологической загрязненности различныхобъектов, тестировании антибиотиков и определении цитотксичности.

В стандартном вариантеАТP-метрии предел обнаружения составляет 104 – 105 КОЕ/мл [16-20]. Для повышенияспецифичности метода используют специфические лизирующие агенты, предварительноеобогащение образца в специфической среде, а также комбинацию данного метода с методомиммуномагнитного осаждения, что позволяет дифференцировать различные клеточные штаммыисеротипы[18-20].Улучшенноймодификациейэтогометодаявляетсясочетаниеиммуномагнитного осаждения и АТP-метрии с аденилат-киназным усилением, либо сиспользованием предварительного концентрирования микроорганизмов путем фильтрацииобразца через мембранный фильтр (0,45 мкм) [21]. В этих модификациях метод позволяетопределять 102 КОЕ/мл E.coli в течение 1 часа [22].

В настоящее время активное развитиеполучила так называемая локальная АТP-метрия [23, 24], основанная на иммобилизациилюциферазы на поверхности мишени с последующей детекцией ATP в режиме реальноговремени. Данный метод находит применение при изучении межклеточной пуринергическойпередачи сигнала, опосредованной пуриновыми нуклеотидами и нуклеозидами, активациииммунных клеток и регуляции других сложных физиологических процессов [25-27].Методы, основанные на детекции люциферина. Эта группа методов основана наиспользовании производного люциферина, содержащего пептидную последовательность,распознаваемую протеазами, которое в нерасщепленной форме не является субстратомлюциферазы.Вприсутствиипротеазнаблюдаетсяселективноерасщеплениеэтогопроизводного с образованием люциферина, способного вступать в биолюминесцентнуюреакцию. Эта группа методов используется в основном для анализа цитотксичности и детекцииживых и мертвых клеток в клеточных культурах.

Живые клетки генерируют слабый фоновыйсигнал. В случае повреждения клеток происходит высвобождение протеаз и, как следствие,увеличение биолюминесцентного сигнала [28, 29]. На основании этого принципа разработанывысокочувствительные миниатюрные системы в 1536-луночном формате для скринингабиблиотеки цитотоксичных соединений [28], а также системы для изучения активностипротеасом (мультиплексное определение активности протеаз) [30, 31].14Полиферментные системы. Еще одним направлением использования люциферазыявляется ее применение в полиферментных системах, в которых анализируется либо вещество,вступающее в реакцию, сопряженную с синтезом АТP под действием киназ, либо сама киназнаяактивность [32]. Одним из первых примеров таких систем стал анализ неорганическогопирофосфата (PPi), разработанный П.

Ниреном и А. Лундиным в 1985 году [33]. В основеанализа лежала реакция превращения PPi в ATP под действием ATP-сульфурилазы, которыйзатем вступал в люциферазную реакцию. Этот метод лег в основу пиросеквенирования [34] иуспешно используется в наше время в технологии нового поколения секвенирования ДНК [35].Полиферментная система для изучения киназной активности была создана в 1978 году А.Лундиным и его коллегами, для изучения активности креатин-киназы, катализирующейперенос фосфатной группы с креатинфосфата на ADP с образованием АТP, который в своюочередь детектировали с использованием люциферазы (Рис. 4) [36].Рис.

4. Схема детекции креатинкиназной активности с использованием люциферазы [36]Данный метод нашел продолжение для определения цитотоксичности (1997 г), ивключал в себя измерение вытекания глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы из мертвых илиповрежденных клеток, которая катализировала синтез АТP, концентрацию которого измеряли сиспользованиемлюциферазы[37].Внастоящеевремясоздаютсяболеесложныеполиферментные системы, например, португальскими учеными была разработана трехферментная система, позволяющая детектировать монооксид азота (·NO). В основе методалежала реакция, катализируемая глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназой (GAPDH), продукткоторой являлся субстратом фосфоглицерат киназы, генерирующей ATP, детектируемый сиспользованием люциферазы.

В присутствии ·NO, наблюдалось ингибирование GAPDH и, какследствие, биолюминесцентный сигнал снижался [38].2.1.2. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на ее детекциикак маркераПрименение гена люциферазы в качестве гена-маркера. Ген люциферазы может бытьиспользован для изучения уровня экспрессии белка в клетке, активности различныхпромоторов, анализа действия различных эффекторов на рецепторы [39], а также для15выяснении локализации клеток-мишеней в организме и других веществ [40, 41].

В качествепримеров можно привести конструкцию, в которой ген люциферазы находился под контролеммультифункционального промотора, которая была использована для идентификации лигандов крецептору с семью трансмембранными доменами (7TM) [42]. В другой генноинженернойконструкциипередгеномлюциферазыпоместилиспецифическуюрегуляторнуюпоследовательность, влияющую на экспрессию биолюминесцентного белка в присутствиианалита. Данная конструкция позволяла проводить анализ веществ, нарушающих работуэндокринной системы (хлорированных бифенолов и различных пестицидов) путем изучения ихэстрогенной и андрогенной активности [43-45]. В работе [46] был разработан анализ киназнойактивности ДНК метилтрансферазы. Принцип анализа заключался в том, что ДНК-мишень,кодирующая люциферазу и необходимые регуляторные элементы, в присутствии активнойДНК метилтрансферазы метилируется по аденинам и устойчива к воздействию эндонуклеазы.Это приводит к экспрессии люциферазы in vitro и появлению биолюминесцентного сигнала.При отсутствии или низкой активности ДНК метилтрансферазы ДНК-мишень подвергаетсяполному или частичному расщеплению, что приводит к отсутствию или низкому уровнюэкспрессии люциферазы и, как следствие, к низкому биолюминесцентному сигналу, которыйпропорционален активности ДНК метилтрансферазы.

Данный метод обладал низким пределомобнаружения (0,08 ед/мл) и широким линейным диапазоном (0,2-100 ед/мл) [46].Применение гена люциферазы в иммуноэкспрессионном анализе основано навключенииеговсоставпоследовательностиДНК,образующейспецифическийиммунокомплекс с мишенью (Рис. 5).Рис. 5. Иммуноэкспрессионный анализ с использованием гена люциферазы светляков [47]Антиген,иммобилизованныйнаповерхностимикрокюветы,связываетсясантиген-специфическими биотинилированными антителами. Полученный комплекс детектируется сиспользованием комплекса стрептавидин-ДНК, кодирующая люциферазу и регуляторныеэлементы, необходимые для ее транскрипции/трансляции (T7-Luc DNA), при этом структуракомплекса стрептавидин-ДНК может варьироваться. В данном случае T7-Luc DNA выступает16как молекула–репортер.

После стадии транскрипции/трансляции, происходящей in vitro,нарабатываются молекулы люциферазы, генерирующие биолюминесцентный сигнал [47-49].Применение гена люциферазы в гибридизационном анализе нуклеиновых кислотосновано на включении его в состав последовательности ДНК, образующей специфическийкомплементарный комплекс с ДНК-мишенью. ДНК-мишень перед проведением анализаденатурируется и гибридизуется с двумя пробами, одна из которых отвечает за иммобилизациюДНК-мишени на поверхности планшета, другая проба отвечает за связывание молекулойрепортером. После гибридизации, экспрессии люциферазы и добавления субстратовдетектируется биолюминесцентный сигнал, пропорциональный концентрации ДНК-мишени[50].