Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 2

pyralis и L. lateralis,однако они запатентованы.По получению стрептавидин-люциферазы опубликована лишьодна работа, в которой было показано, что синтезированный гибридный белок обладал низкойбиолюминесцентной активностью. В связи с этим актуальной задачей является создание новыхгенно-инженерных систем для получения биотинилированной люциферазы и стрептавидинлюциферазы с высокой люциферазной и специфической активностью на основе люциферазысветляков Luciola mingrelica.Целью работы является получение специфических реагентов на основе люциферазысветляков Luciola mingrelica, изучение их свойств, и их применение в биоспецифическоманализе.

В рамках исследования были поставлены следующие задачи:1) Получение на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica гибридных белков:биотинилированной люциферазы и стрептавидин-люциферазы, - изучение их каталитических ибиохимических свойств.72) Применение полученных гибридных белков в биоспецифическом анализе на основе биотинстрептавидиновых взаимодействий на примере гетерогенного иммуноанализа клеток Salmonellaи гибридизационного анализа специфических фрагментов ДНК клеток E. coli.3) Создание новой системы для высокоэффективного биолюминесцентного резонансногопереноса энергии (BRET) на основе конъюгатов различных мутантных форм термостабильнойлюциферазы Luciola mingrelica с низкомолекулярным антигеном и конъюгатов красителяAlexa-Fluor с антителами.4) Разработка метода гомогенного иммуноанализа низкомолекулярного антигена (прогестерона)на основе BRET с использованием конъюгатов люцифераза-прогестерон и конъюгатов антителк прогестерону с красителем.Научная новизна.

В ходе выполнения данной работы впервые получены плазмиды,кодирующие гибридные белки люцифераза-биотин-связывающий домен (Luc-bccp-His6) илюцифераза-стрептавидин:SA-Luc-His6,SA-Luc-His6M/G,His6-SA-Luc,Luc-SA-His6сиспользованием гена высокоактивного и термостабильного мутанта люциферазы светляковLuciola mingrelica. Впервые получен гибридный белок люцифераза Luciola mingrelica - биотинсвязывающийдомен(Luc-bccp),биотинилированныйinvivo,обладающийвысокойбиолюминесцентной активностью и способностью связывать стрептавидин. Показано, чтокаталитические свойства, термостабильность и спектры биолюминесценции гибридного белкаLuc-bccp и исходной люциферазы идентичны. Впервые получены гибридные белкилюцифераза-стрептавидин, для которых показано, что олигомерный состав, люциферазнаяактивность и сродство к биотину зависят от взаимного расположения доменов люциферазы,стрептавидина и His6 последовательности.

Показано, что гибридный белок His6-SA-Lucобразуется преимущественно в тетрамерной форме, обладающей высокой люциферазнойактивностью и высоким сродством к биотину. Показана эффективность примененияполученных гибридных белковвбиоспецифическоманализенаосновебиотин-стрептавидиновых взаимодействий на примере гетерогенного иммуноанализа клеток Salmonellaи гибридизационного анализа специфических фрагментов ДНК клеток E. сoli. Разработан методзначительногоснижениянеспецифическойсорбциигибридногобелкалюцифераза-стрептавидин с использованием плюроника, приводящий к увеличению чувствительностианализа.Разработанвысокоэффективныйметодполученияконъюгатовлюциферазыспрогестероном (Luc-Pg) и антител к прогестерону с красителем Alexa-Fluor 610-x (Fl-Ab).Конъюгаты обладают высокой активностью и сохраняют биохимические и физикохимическиесвойства исходных реагентов.

Оптимизирован состав конъюгатов Luc-Pg и Fl-Ab для8регистрации высокоэффективного биолюминесцентного резонансного переноса энергии(BRET). Для повышения эффективности регистрации BRET-сигнала методом генетическойинженерии получен новый термостабильный мутант люциферазы светляков Luciola mingrelica(GLuc) с максимумом биолюминесценции при 550 нм и конъюгаты с прогестероном на егооснове. Разработан высокочувствительный метод гомогенного иммуноанализа прогестерона наоснове BRET с использованием конъюгатов GLuc-Pg и Fl-Ab. По сравнению с гетерогеннымИФА на основе биолюминесцентного метода детекции с использованием тех же конъюгатовGLuc-Pg, метод на основе BRET позволяет сократить время проведения анализа и обладаетменьшей трудоемкостью.Практическая ценность работы. В результате проведенного исследования разработанаметодология использования люциферазы светляков L.

mingrelica в биоспецифическом анализе.Синтезированы высокоактивные рекомбинантные белки, которые являются перспективнымиреагентами для создания новых высокочувствительных биоаналитических систем на основебиотин-стрептавидиновых взаимодействий. На ряде примеров показано, что гибридный белокстрептавидин-люцифераза является высокоэффективным реагентом для специфическойдетекции клеток микроорганизмов на основе биотин-стрептавидиновых взаимодействий как сиспользованием иммуноанализа, так и с использованием гибридизационного анализаспецифических последовательностей ДНК клеток микроорганизмов. Показана высокаяэффективность использования люциферазы и ее мутантных форм в качестве донора вбиоаналитических системах на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергиисовместно с флуоресцентными красителями нового поколения в качестве акцепторов, чтооткрывает новые перспективы использования люциферазы для скрининга различных аналитов свысокой пропускной способностью.Положения, выносимые на защиту: Генноинженерные конструкции, использованные для получения гибридных белков наоснове люциферазы светляков L.

mingrelica с биотин-связывающим доменом (Luc-bccp)и со стрептавидином (Luc-SA), а также результаты по изучению их структуры, физикохимических и биохимических свойств. Методы иммуноанализа клеток Salmonella и детекции ДНК клеток E. coli сиспользованием полученных гибридных белков. Получение нового термостабильного мутанта люциферазы L. mingrelica (GLuc) смаксимумом биолюминесценции в «зеленой» области спектра и результаты по егоиспользованию в качестве донора в биолюминесцентном резонансном переносеэнергии на акцептор (краситель).9 УсловияполученияхимическихконъюгатовлюциферазыL.mingrelicaснизкомолекулярными соединениями на примере прогестерона и данные об их составе,стабильности, люциферазной активности и способности связывать антитела. Метод гомогенного иммуноанализа прогестерона на основе биолюминесцентногорезонансного переноса энергии с использованием конъюгатовлюцифераза-прогестерон и антител к прогестерону с красителем Alexa-Fluor 610-x.Апробацияработы.Основныерезультатыработыбылипредставленынамеждународных и всероссийских конференциях: VI съезде Российского фотобиологическогообщества(пос.Шепси,Россия,2011);VIМосковскоммеждународномконгрессе"Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2011); 17th InternationalSymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Гуэльф, Канада, 2012); IV съездебиофизиков России (Нижний Новгород, Россия, 2012); VII Московском международномконгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2013); 15 th JCFSpring Symposium (Берлин, Германия, 2013); международной конференции "Biocatalysis-2013.Fundamentals & Applications" (Москва, Россия, 2013); Chemistry Conference for Young Scientists(ChemCYS 2014), (Бланкенберге, Бельгия, 2014); 16th JCF Spring Symposium (Йена, Германия,2014 г); VII съезде Российского фотобиологического общества (пос.

Шепси, Россия, 2014); 18thInternational Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Уппсала, Швеция, 2014).Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьив реферируемых научных журналах (входящих в перечень научных изданий, рекомендуемыхВАК РФ) и 10 тезисов докладов на научных конференциях.102.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ2.1. Люциферин-люциферазная система светляков и еебиоаналитических применениеЛюцифераза светляков – фермент, катализирующий окисление люциферина светляков поддействием кислорода воздуха в присутствии ATP и Mg 2+ [1-3]. Данная реакция сопровождаетсяизлучением света видимой области спектра (540-600 нм). Квантовый выход данной реакциисоставляет по разным данным от 41% [4] до 90% [5] и является одним из наиболее высоких средидругих биолюминесцентных систем.

Кинетический механизм реакции окисления люциферинабыл подробно изучен [3, 6]. Краткая схема реакции приведена на Рис. 1O7'HO31'S6'N2'2N5'4'3'SCOOH4+ATPSPPiOSNNSNN51(1)HOHOOO-AMPS+O2AMP, H+(2)-OOSNNSSNNSCOO.-COCO2(3)-OSNNO *-hS(4)OOРис. 1. Схема реакции окисления люциферина в присутствии люциферазы светляков и ATP [3]Реакция состоит из двух основных этапов – аденилирования и окисления. На первойстадии фермент связывается c субстратами – люциферином (1) и аденозин-5’-трифосфатом(ATP).

В тройном фермент-субстратном комплексе люциферин ковалентно взаимодействует сATP, и в результате образуются смешанный ангидрид карбоновой и фосфорной кислот –люциферил-аденилат (2) и пирофосфат. Далее люциферил-аденилат через ряд промежуточныхстадий окисляется кислородом воздуха, превращаясь в циклический пероксид – диокситанон(3). Трансформация диокситанона приводит к образованию бирадикала, в результатедекарбоксилирования которого образуется продукт реакции – оксилюциферин (4) в синглетномэлектронно-возбужденномсостоянии.Затемэлектронно-возбужденныйоксилюцифериндезактивируется с излучением кванта света.11Люцифераза состоит из двух доменов: большого N-домена (1-436 остатки) и малого Cдомена (443-544 остатки), соединенных подвижной петлей (337-442 остатки). В свою очередь, вN-домене можно выделить два явно выраженных субдомена [7]: A (1-190) и B (191-436),образующих между собой прочный гидрофобный контакт (Рис.

2).Рис. 2. Структура люциферазы светляков L. cruciata в комплексе с DLSA [8].При связывании фермента с субстратом на стадии аденилирования происходит поворотC-домена примерно на 90° относительно N-домена, что приводит к переходу от открытойконформации люциферазы к закрытой, при которой оба домена находятся в тесном контакте.При этом Thr529 образует водородные связи с β- и γ- фосфатами ATP, а Lys531,расположенный на равном расстоянии между карбоксильной группой люциферина и αфосфатной группой ATP способствует их сближению, что является лимитирующей стадией вреакции образования аденилат-люциферина [9, 10].