Отзыв официального оппонента, д.ф.-м.н. В.В. Смолянинова (Молекулярно-механическая модель динамики микротрубочки)

Отзыв официального оппонента на диссертационную работу Захарова Павла Николаевича «Молекулярно-механическая модель динамики микротрубочки», представленной на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.01.02 — Биофизика Актуальность темы исследования Микротрубочки представляют из себя полые трубки диаметром около 25 нанометров, стоставленные из белка тубулина. Микротрубочки важны для целого ряда клеточных процессов. Они формируют цитоскелет, поддерживающий форму клетки, в делящихся клетках они образуют митотическое вретено деления„необходимое для разделения пополам между дочерними клетками генетического материала исходной клетки.

Также микротрубочки играют ключевую роль в хемотаксисе, нейродифференцировке, участвуют во внутрекл сточном транспорте. Динамическая нестабильность — это уникальная способность данного биополимера испытывать переходы между фазами роста и разборки. Данный феномен наблюдается как в клетке, так и в эксперименте 1п ч1гто с очищенным тубулином. Удивительным аспектом динамической нестабильности является так называемое «старение» микротрубочек: чем больше прошло времени с момента начала полимеризации микротрубочки, тем больше для нее вероятность испытать катастрофу. Существует немало моделей, с помощью которых исследователи пытались описать свойства микротрубочки.

Однако объяснение молекулярного механизма катастрофы, старения, а также полное описание свойств микротрубочки в рамках единого набора параметров до сих пор сделать не удавалось, Таким образом, эта задача остается важным и нерешенным вопросом современной биофизики. Научная новизна Диссертантом была создана новая молекулярно-механическая модель микротрубочки на основании метода броуновской динамики, в которой он рассматривает все составляющие динамики исследуемого объекта: присоединение молекул тубулина, гидролиз ГТФ, диссоциацию молекул. Отличительным свойством данной модели является то, что она в явном виде содержит термодинамические флуктуации и энергетические потенциалы взаимодействия, что означает учет влияния механических взаимодействий и тепловых флуктуаций на разрыв связей между субъединицами.

Эта работа впервые позволила описать все основные свойства микротрубочки в рамках одного набора параметров и предложить непротиворечивое объяснение молекулярного механизма катастроф и старения микротрубочки. Практическая значимость научной работы В диссертационной работе была предложена детальная модель микротрубочки и проделан тщательный анализ свойств данного биополимера. Подобный анализ существенно расширил современные представления о том, как конфигурация микротрубочки влияет на ее динамическую нестабильность, как происходят катастрофы В частности, полученное понимание влияния отгибающихся протофнламентов на динамическую нестабильность может помочь регулировать катастрофы микротрубочек в митотических клетках, например раковых, что имеет терапевтические перспективы. Созданная модель также может быть использована для исследования механизма спасения микротрубочек, может лечь в основу более сложной модели взаимодействия микротрубочки с сайтами ее взаимодействия на хромосоме.

Достоверность результатов Достоверность результатов, полученных в диссертационной работе, подтверждается использованием апробированных математических методов, широко используемых в мировом научном сообществе, а также статистическим анализом и согласием полученных результатов с опубликованными другими авторами данными.

Структура н содержание работы Диссертация построена по традиционному образцу и состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы. Объем работы — 105 страниц, включающих 46 рисунков, 2 таблицы, список из 127 литературных источников, процитированных в диссертации. Во введении рассматриваются цели и задачи исследования, положения, выносимые на защиту, приводятся актуальность и практическая значимость работы, обозначена научная новизна работы. В первой главе автор разбирает историю исследования свойств микротрубочки как с теоретической, так и с экспериментальной точки зрения. В этом разделе подробно описывается механизм роста микротрубочки, когда отдельные димеры белка тубулина, связанные с молекулой гуанозинтрифосфата (ГТФ) прикрепляются к торцу микротрубочки. После прикрепления к концу микротрубочки ГТФ, связанная с молекулой р-тубулина, испытывает гидролиз.

Гидролиз ГТФ приводит к изменению конформации в димере тубулина и возникновению изгибного напряжения, стремящегося выгнуть димеры наружу от центральной оси микротрубочки. Однако не успевшие еще испытать гидролиз молекулы ГТФ, находящиеся на конце микротрубочки, удерживают ее от разборки и засчет них трубочка может расти. Димеры ГТФ-тубулина, находящиеся на конце растущей микротрубочки, принято называть ГТФ-колпачком. Диссертант в первой главе подробно излагает экспериментальные и теоретические исследования размера ГТФ- колпачка, необходимого для роста микротрубочки, Далее вводится понятие катастрофы — спонтанной остановки роста микротрубочки и переход ее в состояние быстрой деполимеризации, спасения — переход от деполимеризации ко спасению, а также общее определение динамической нестабильности — способности микротрубочки испытывать катастрофы и спасения при постоянных внешних условиях.

Рассматривается явление «старения» — склонность более долго растущих мнкротрубочек испытывать катастрофы чаще. Диссертант в этом разделе также уделяет большое внимание математическому моделированию динамической нестабильности микротрубочки. Он описывает ряд методов, используемых для моделирования микротрубочки, а также разбирает основные математические модели, приводя их достоинства и недостатки. Вторая глава называется «Материалы и методы». В этой главе диссертант описывает созданную в рамках его работы молекулярно-механическую модель микротрубочки. Дается описание того, как взаимодействуют мономеры тубулина в стенке микротрубочкн. Элементарная субъединица в модели — недеформируемый шар радиусом 2 нм, описывающий мономер. На его поверхности находятся сайты связывания с соседними субъединицами: два боковых взаимодействия и два продольных.

Димеры, связанные продольными связями, склонны образовывать прямую структуру в ГТФ состоянии, и изгибаться в случае, если они связаны с ГДФ. Модель является по сути гибридной — она описывает взаимодействия связанных димеров и разрыв связей с помощью динамики, а присоединение новых субъединиц и гидролиз ГТФ описывается с помощью вероятностной кинетической части алгоритма. Также в «материалах и методах» диссертант описывает как он считал скорости роста, укорочения, время до наступления катастрофы. В этом разделе вводится отдельная упрощенная кинетическая модель множественных переходов для анализа многоступенчатой природы катастрофы. Третьи глава содержит результаты работы. Начинается она с процедуры выбора параметров энергетического взаимодействия в модели.

Затем, проводится верификация модели, по сути сравнение результатов расчетов с экспериментальными данными, описывающими микротрубочку. Сюда входят концентрационные зависимости, феномен старения, объяснение времеми до наступления деполимеризации при удалении растворимого тубулина из камеры после продолжительного роста микротрубочки. В результате диссертант последовательно доказывает, что его модель может описать все основные свойства микротрубочки в рамках одного набора параметров. Следует добавить, что более ранние модели такого сделать не могли.

Далее диссертант исследует влияние конфигурации конца микротрубочки на ее стабильность и показывает, что образование отогнутых протофиламентов способствует катастрофам. После этого приводятся аргументы, говорящие о том, что катастрофы являются обратимыми событиями, а старение микротрубочки можно объяснить накоплением 10 и более отогнутых протофиламентов на ее конце. В четвертой главе диссертант обсуждает феномен старения микротрубочки и пытается объяснить механизм этого явления на молекулярном уровне.

С помощью дополнительной кинетической схемы множественных переходов автор показывает, что катастрофы могут быть объяснены обратимыми событиями с характерным временем жизни на 1-2 порядка меньшим времени жизни микротрубочки, такими как возникновение отогнутых протофиламентов на конце микротрубочки. Само же возникновение отогнутых протофиламентов как раз дестабилизирует микротрубочку и является обратимым. При этом возникновение в популяции таких микротрубочек, у которых 10 и более отогнутых протофиламентов, растет по мере роста микротрубочек с тем же характерным временем, что и частота катастроф.

На основании этих данных диссертант делает заключение, что возникновение отгибаюшихся протофиламентов может объяснить катастрофы и сам феномен старения. В заключении диссертант приводит основные результаты и выводы диссертационной работы. Замечания по диссертационной работе. Принципиальных замечаний по данной диссертационной работе нет, однако есть замечания к написанию формул, которые можно рассматривать скорее как опечатки.

А именно, в формуле (16) есть индексы к и и в левой части выражения, связь которых с правой частью не указана. Данное замечание носит частный характер и не влияет на высокий уровень диссертации в целом. Общее заключение.

Диссертационная работа Захарова Павла Николаевича «Молекулярно-механическая модель динамики микротрубочки» является научным исследованием, выполненным на высоком уровне. Диссертант успешно решил поставленные задачи и добился значимых результатов. Положения работы были представлены на нескольких международных научных конференциях, опубликованы в трех статьях в журналах из списка ВАК.

Автореферат и публикации в полной мере отражают содержание диссертационной работы. Главный научный сотрудник Института Машиноведения им. А.А. Благонравова РАН, лаборатория «Исследований биомеханических систем» д.ф.-м.н. Смолянинов В.В. Адрес: 101990, Москва, Малый Харитоньевский пер., д.4. Тел Уфакс: 8-499-135-30-47. эл~.: щщаэщащащ Подпись д.ф.-м.н.

Смолянинова Вф)доверяв!ээ Начальник отдела кадров ИМАЕВ'„.~~Й:",," ',;:!'!-;~ Петюков Э.Н. Диссертационная работа Захарова П.Н. отвечает требованиям «Положения о порядке присуждения ученых степеней», утвержденного постановлением правительства Российской Федерации от 24 сентября 2013 года №842, предъявляемому к кандидатским диссертациям, а ее автор Захаров Павел Николаевич без сомнения заслуживает присуждения искомой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.01.02 — Биофизика. .