Отзыв официального оппонента доктор биологических наук Муравьева А.В. (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов)

Отзыв официального оппонента на диссертационную работу Ли Кнсуна «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭРИТРОЦИТОВ В СРЕДАХ, ИНДУЦИРУЮЩИХ ИХ АГРЕГАЦИЮ: ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНЫХ ПИНЦЕТОВ»„представленную на соискание ученой степени кандидата фнзико-чатематических наук по специальности 03.01.02 - Биофизика» Актуальность темы Диссертационная работа Ли Кисуна посвящена исследованию проблемы клеточного взаимодействия, на примере агрегации эРитроцитов. Агрегация эритроцитов является удобной и информативной моделью объединения отдельных клеток в комплексы, поскольку позволяет испольювать очень чистую клеточную линию — эритроциты, а процесс их объединения в агрегаты хорошо визуализируется, Изучение закономерностей обратимого объединения отдельных клеток в агрегаты, в основном гю типу «монетных столбиков», позволяет лучше понять и опенить суспензионную стабильность крови в системе кровообращения, а также роль агрегации эритроцитов в регуляции транскапиллярного обмена путем создания градиента сосудистого сопротивления в артериолах и венулах микрососудистого русла.

Кроче того, агрегация эритроцитов участвует в распределении других клеток крови в потоке, например, при перемещении лейкоцитов и тромбоцитов к сосудистой стенке для последующей адгезии к ней, Вместе с тем точные молекулярные механизмы агрегации эритроцитов остаются не достаточно изученными. Таким образом„проведенное диссертационное исследование Ли Кисуна, посвященное изучению механизмов взаимодействия отдельных эритроцитов прн их агрегации и дезагрегации и выявление роли макромолекул в этом процессе с помощью техники лазерных пинцетов, является актуальным, Научная новизна Научная новизна диссертационной работы Ли Кисуна заключается в том, что им разработана новая методика измерения силы взаимодействия пары эритроцитов при формировании агрегационного дуплета. Это было выполнено с помощью лазерных пинцетов в разных агрегирующих средах: 1) в растворах белков плазмы крови 1фибриноген, альбумины и глобулины); 2) в растворах длинноцепочечных полисахаридов (декстраны); 3) в нативной плазме и сыворотке крови.

Были получены новые факты, свидетельствующие о том, что силы, регистрируемые при объединении клеток в пару и при их дезагрегации, различны. Это наиболее заметно проявляется при использовании разных суспензионных сред. Последнее свидетельствует о важной роли состава и свойств агрегационной среды для процесса агрегации/дезагрегации эритроцитов. Кроме того, автором диссертации была предложена новая гипотетическая модель для описания экспериментальных данных на основе анализа взаимодействия пары эритроцитов в разных агрегнрующих средах.

Новым экспериментальным подходом является сравнительный анализ процесса агрегации эритроцитов, зарегистрированного в пробах цельной крови и при моделировании процесса с отдельными эритроцитами из суспензин отмытых клеток. Автором диссертации впервые исследованы зависимости агрегационного поведения пары эритроцитов от содержания веществ в суспензионной среде. Это еще раз подчеркивает зависимость спонтанной агрегации эритроцитов не только от собственной способности к объединению в агрегаты, но и от макромолекулярного состава агрегационной среды. Теоретическая и практическая значимость диссертационной работы Работа Ли Кисуна имеет несомненную теоретическую и практическую значимость. Применение разработанной методики измерения сил взаимодействия эритроцитов человека с помощью лазерных 'пинцетов позволит продвинуться в исследовании биофизических механизмов агрегации эритроцитов, как в норме, так и прн различных заболеваниях.

Методика измерения сил взаимодействия эритроцитов с помощью лазерных пинцетов позволит лучше понять механизмы взаимодействия клеток при формировании агрегатов, может внести уточнения в имеюшиеся теоретические модели агрегацин и показать точки их взаимодействия. Несомненно, разработанные методы н экспериментальные подходы могу применяться для исследования биофизических закономерностей взаимодействия клеток организма и другого типа. Кроме того„разработанная методика измерения сил взаимодействия эритроцитов может быть эффективно использована для комплексных исследований связи микрореологических свойств эритроцитов с параметрами микроциркуляции в модельных опытах на лабораторных животных, как в норме, так и при патологии, Структура и основное содержание диссертационной работы Диссертация построена по традиционному образцу, содержит введение, обзор литературы, описание организации, материалов и методов исследования, а также результаты, их обсуждение, выводы, список литературы и список сокращений.

Текст изложен на 96 страницах, содержит 4 главы, иллюстрирован 2 таблицами и Зб рисунками, Библиографический указатель включает 143 источника. Во введении дастся обоснование выбранного направления исследований, перечисляются основные достижения в этой области знания.

В подробном и интересном обзоре литературы„ объемом 32 страницы, аккуратно и точно описаны основные сведения об агрегацин эритроцитов и методах ее исследования. Дано описание процесса агрегации и ее роли в реологии крови. Описаны условия, при которых происходит процесс агрегации, указаны факторы, изменяющие ее величину и интенсивность. В обзоре рассмотрены существующие модели взаимодействия эритроцитов при агрегации. Показана физиологическая роль агрегации эритроцитов„а также ее изменение при патологии и возможный вклад в ишемизацию тканей.

На основе литературных данных автор оценивает факторы, влияющие на изменение характеристик агрегационного процесса, анализирует роль факторов среды и собственной агрегируемости эритроцитов. Здесь же рассмотрены методики измерения агрегации и оценка ее последствий.

Мотивирует проведение собственного диссертационного исследования анализ литературных данных о молекулярных механизмах агрегационного процесса, роли белков плазмы и других макромолекул в клеточном взаимодействии. Достаточно глубоко проанализированы две основные модели агрегации эритроцитов: «мостиковая модель» и модель «обедненного слоя». Рассмотрены существующие гипотезы, объясняющие процесс агрегации эритроцитов.

Обзор демонстрирует хорошее знание диссертантом литературы и в том числе работ последних лет, а также умение анализировать подчас противоречивые литературные данные. В методическом разделе описаны организация исследования, процедура подготовки использовавшихся экспериментальных образцов, экспериментальная установка и принцип ее работы, процедура измерения параметров, характеризующих взаимодействие эрнтроцитов„ и процедура обработки и анализа полученных данных. В работе использовались цельная кровь и отмытые эритроциты нескольких здоровых добровольцев. Организация проведения опытов выполнена методически правильно.

Все эксперименты проводились ~и ппо. Кровь для экспериментов забиралась из локтевой вены илн из пальца. Измерения проводились в течение нескольких часов после взятия крови, согласно принятым правилам. В качестве антикоагулянта использовался ЭДТА. О надежности и достоверности полученных данных можно судить на основе того, что измерения характеристик агрегацни проводились на статистически достаточном объеме выборки (более чем на 2000 парах эритроцитов).

Результаты экспериментов усреднялись по измерениям на эритроцитах крови нескольких доноров. Основной вклад в погрешность полученных результатов (разброс значений), как справедливо полагает диссертант, вносило индивидуальные отличия эритроцитов друг от друга. В третьей главе описаны методика и результаты измерений динамики взаимодействия эритроцнтов при их спонтанной агрегации.

Проведено сравнение полученных результатов с литературой, выполнено их обсуждение и сделаны выводы. В разделе «Результаты исследования» приведены интересные данные о существенных различиях в спонтанной агрегапии эритроцитов (САЭ) в разных инкубационных средах. Новые и весьма важные данные получены автором диссертации в отношении роли белков плазмы в агрегации. Им было показано, что в приготовленных растворах фибриноген ни сам по себе данный белок ни в совокупности с альбумином не вызывает агрегации. На основе этих наблюдений делается важный вывод о том, что в процессе САЭ ключевую роль играет синергетический эффект фибриногена с другими компонентами плазмы. Более того, автором было показано, что для инициирования процесса агрегации эритроцитов недостаточно присутствия в среде только фибриногена и альбумина, а необходим рад дополнительных условий.