Отзыв официального оппонента д.ф.-м.н.Баграташвили В.Н. (Термочувствительные покрытия и материалы для клеточных технологий и доставки лекарств)

Отзыв официального оппонента на диссертацию РОЧЕВА Юрия Алексеевича "ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОКРЫТИЯ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ", представленную на соискание ученой степени доктора физико-математических наук по специальностям 03.01.02 — ((Биофизика», 03.01.08 — ((Биоинженерия» Вызовы современной медицины, фармации и биоинженерии потребовали разработки и создания широкого класса новых искусственных биоматериалов.

Среди них особую важность представляют материалы, которые обладают физико-химическими и био-химическими свойствами, хорошо настраиваемыми путем изменения состояния внешней среды или внешними физическими воздействиями. Большой интерес эти адаптивные материалы (в первую очередь - полимеры) представляют для таких прорывных областей как тканевая инженерия 1создание адаптивных матриц-носителей клеток) и лекарственные формы адресного и пролонгированного действия.

В связи с этим весьма актуальной является представленная диссертационная работа Рочева Ю.А., посвященная разработке нового класса "адаптивных" биосовместимых термочувствительных полимерных покрытий на основе полимеров с нижней критической температурой растворимости 1НКТР) и направленная на решение следующих основных задач: разработка и создание тонких 110 нм -1О нм) термочувствительных покрытий с НТКР в диапазоне 5 — 36 'С, определение их ключевых физико-химических характеристик; определение закономерностей роста, открепления клеток и клеточных пластов от термочувствительных материалов в зависимости от свойств полимеров; определение закономерностей бесферментного снятия клеток, роста и дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток: экспериментальное и теоретическое исследование кинетики выхода лекарств из термочувствительных покрытий; разработка устройства для стимуляции выхода лекарств из термочувствительных полимерных покрытий.

Работа явно сфокусирована на использование новых адаптивных полимеров в клеточных технологиях (в частности, для получения изолированных клеток и клеточных пластов без применения протеолнтических ферментов или каких-либо других биохимических агентов) а также - для локальной управляемой термо-контролируемой доставки лекарств. Диссертационная работа Рочева Ю.А. состоит из Введения, 4х глав, выводов и списка цитируемой литературы. Во Введении к работе представлена общая характеристика работы, обоснована актуальность исследований, сформулированы цели и задачи работы, изложена новизна полученных результатов и дана информация об апробации основных результатов работы.

В Главе 1 разработаны методы получения термочувствительных поверхностей с малой шероховатостью (ВМЯЛО нм), заданной толщиной в диапазоне 10 нм -1О нм и обладающих модулем 1Онга 3-5 ГПа. Основное внимание уделено трем группам полимеров с НКТР: 1) сополимеры М- изопропилакриламида и 1Ч-трет-бутилакриламида (поли-()ч"-ИГ1ААм-со-М-трет-БААм)), а также сополимеры М- изопропилакриламида и акриламндобензофенона (поли-(1Ч-ИПААм-со- ААБФ; 2) поли-()У-нзопропилакриламнд) (поли-Ф-ИПААм) со среднечисловой молекулярной массой Мп в диапазоне 20-25КД. 3) Сополимеры М-изопропилакриламида н этилпирролидон метакрилата (поли-(М-ИПААмсо-ЕПМ)).

Отмечу, что новый класс гидрофильных сополимеров на основе М- изопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата (с НКТР диапазоне 33'С - 36'С), поддерживающие рост клеток и обеспечивающие бесферментнос снятие клеток, впервые получен и охарактеризован в работах автора диссертации. Глава 2 посвящена изложению результатов исследования физико-химических характеристик полученных покрытий. Так, автором охарактеризованы покрытия на основе Х-изопропилакриламида и Х-треш-бутилакриламида с различными молярнымн соотношениями мономеров и с НКТР в диапазоне 9'С - 32'С. Предложены и реализованы интересные методы улучшения питосовместимостн данных покрытий путем увеличения содержания Х-гарет-бутилакрнламида, а также применения факторов адгезии таких как коллаген, ламинин, фибронектин и поли-1,- лизин.

Установлено, что применение метода центрнфугирования для нанесения покрытий позволяет получать термочувствительные поверхности на основе Х-изопропилакриламида с краевым углом натекания близким к 50 град, которые поддерживают клеточную пролиферацию н обеспечивают бесферментное открепление клеток. Экспериментально показано, что наиболее значимый полимер с НКТР (поли- У-изопропилакриламид) может быть успешно использован при работах с культурами клеток без какой-либо химической модификации. В главе 3 автором исследовано взаимодействие клеточных культур с полученными термочувствительными покрытиями. Выявлен тот интересный факт, что рост клеток на термочувствительных идрогелях на основе 1Ч-изопропилакриламида и акриламидобензофенона ковалентно связанных с подлежащим субстратом, зависит от толщины покрытий.

Показано, что исключительно ультратонкие покрытия толщиной около 10 им обеспечивают рост клеток и бес ферм ситное открепление клеток и обсуждается механизм такого эффекта.. Предложенные в работе методы бесферментного открепления клеток апробированы на 12-тн типах клеточных культур, включая линии мышиных фибробластов фибробласты Е929, фибробласты почек сирийского хомячка ВНК вЂ” 21, эпителиальные клетки почек зеленой мартышки Чего и НЕр-2 (карцинома гортани), фибробласты ЗТЗ, эпителиальных клеток Не?.а, а также первичные эндотелиальные клетки вены пупочного канатика 1НЕЧЕС) и мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК).

Автором обнаружено, что скорость бесферментного открепления клеток уменьшается с ростом гидрофобностн покрытий. Кроме того, показано, что факторы адгезии клеток специфично уменьшают скорость открепления клеток. Автором также убедительно показано. что при пролонгированном культивировании на подложке из Х- изопропилакриламида мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека не меняют свой фенотнп и сохраняют плюропотентность. При соответствующей индукции дифференцировки МСК, культивируемые на полученных в работе термочувствительных покрытиях, дифференцируются в адипоциты, хондроциты и остеоциты. Глава 4 диссертационной работы направлена на решение проблемы доставки лекарств из термочувствнтельных покрьпий на основе гидрогелей из полн-~Х-ИПААм-со- ААБФ).

Здесь представлена новая математическая модель доставки лекарств из термо- чувствительных гидрогелей, описывающая выход лекарства при циклическом изменении температуры. Модель экспериментально апробирована при исследовании кинетики выхода родамина В из термочувствительных гидрогелей на основе И- нзопропилакриламида и акриламидобензофенона при различных температурах.

Показано хорошее соответствие экспериментальных данных предложенной математической модели. Для реализации метода терморегулируемой доставки лекарств с использованием термочувствительных полимеров в работе предложено и разработано устройство для доставки лекарств из полимеров с нижней критической температурой растворимости на базе элемента Пельтье. Устройство позволяет управлять кинетикой выхода лекарств путем изменения температуры полимера.

Переходя к оценке работы Рочева Ю.А., необходимо отметить ряд ее безусловных достоинств. При очевидной много-дисциплинарности работы 1биофизика, био-инженерия, науки о материалах, клеточная биология, био-химия,) в каждой из отдельных дисциплин автор демонстрирует хорошее знание и понимание "горячих точек"„высокий профессиональный уровень, хорошее владение современными методами исследований. Автор не ограничился чисто экспериментальными исследованиями, но и представил адекватную теоретическую модель кинетики выхода лекарств из термочувствительиых полимеров, а с друтой стороны - разработал практичное устройство для доставки лекарств из полимеров.

Отмечу также, что при всем многообразии решаемых в работе задач, она выглядит вполне цельной, достоверность полученных результатов не вызывает сомнений, а сделанные выводы представляются весьма убедительными. Результаты, полученные в работе, безусловно, являются новыми. Среди них особо отмечу следующие: - получение ряда новых термочувствительных покрытий для роста клеточных культур и бесферментного открепления клеток и клеточных слоев; синтез и характеризация сополимеров на основе Х-изопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата с температурами перехода близким к 37 'С; выявление закономерностей и кинетики открепления клеток в зависимости от смачнваемости термочувствительных покрытий и факторов клеточной адгезии; - надежное доказательство того важного факта, что мсзенхимальные стволовые клетки, культивируемые на гомополимере Х-изопропилакриламида, сохраняют плюропотентность и способность к дифференцировке; разработка эффективного устройства на основе элементов Пельтье для доставки лекарств из полимеров с НКТР.

Отмечу еще одно важное достоинство этой работы, выполненной в последнее двадцатилетие. В этот период исследования в областях тканевой инженерии и лекарственных форм адресного и пролонгированного действия фактически начали особенно интенсивно развиваться во многих лабораториях мира„двигаясь по многим альтернативным направлениям. Целый ряд таких направлений оказался в дальнейшем тупиковым. Автору же удалось почувствовать важность и перспективность термочувствительных полимеров для указанных областей и последовательно провести весь необходимый цикл исследований от разработки и комплексной характеризации полимерных покрытий, до серьезных клеточных исследований и создания необходимой аппаратуры. Работа легко читается, хорошо оформлена и структурирована.

Автор внес определяющий вклад в выполнение этой работы. По результатам работы автором представлен впечатляющий перечень публикаций. К работе имею следующие замечания: 1. В работе для оценки динамики клеточных популяций используются два основных метода: определение общего количества ДНК (метод Р1сойгееп) и оценка метаболической активности клеток (метод А1агпаг В!пе).

Данные полученные на основе этих методов, в целом, демонстрируют хорошую корреляцию, но в некоторых случаях, например, для первичных эндотелиальных клеток человека Н()ЧЕС (Рис. 3.1.11) корреляция не прослеживается. Почему? 2. Для бесферментного открепления клеточных культур температура образцов может находится в широком диапазоне температур, но строго ниже нижней критической температуры растворимости (НКТР).

В работе же температура „при которой открепляются клетки, составлеет 4 С. Целесообразно разъяснить выбор данной температуры. 3. В работе приден детальный анализ краевых углов смачиваемости для многих термочувствительных поверхностей. Однако, автор не всегда четко определяет какой именно из краевых углов исследуется в конкретном эксперименте. Натекания, оттекання или залипания «з11ск».

Об это можно догадаться лишь нз контекста. Отмеченные замечания являются второстепенными и не сказываются на общей исключительно высокой оценке диссертации Рочева Ю.А. Она является ценным, законченным, оригинальным научным исследованием, выполненным в актуальной области науки с применением современных методов исследования, и имеет высокую научную и практическую значимость. Все выводы хорошо теоретически и экспериментально обоснованы, полученные результаты несомненно обладают научной новизной, а их достоверность не вызывает сомнений. Таким образом, работа, безусловно, удовлетворяет всем требованиям ВАК к докторским диссертациям, а ее автор, Рочев Юрий Алексеевич заслуживает присуждения ему ученой степени доктора физико- математических наук по специальности 03.01.02 — «Биофизика», 03.01.08 «Биоинженерня».

Автореферат дает адекватное и достаточно полное представление о содержании диссертации. Заведующий отделом лазерной атомно-молекулярной технологии ФГБУН Институт проблем лазерных н информационных технологий РАН, доктор физ.-мат, наук, профессор /' „~~ В.Н. Баграташвили -'л", l.~ . '.,', РГ'.

Г-~Ю Почтовый адрес: Россия, 142092, г, Троицк Московской обл., ул. Пионерская, 2. Эл. Почта; ис1ог,Ьа га1азйч11Й ша1!,согп Подпись В.Н. Баграташвили заверя Ученый секретарь ИПЛИТ РАН доктор физ-мат. наук, профессор, ф Лебедев .~~ $ .