Создание наноструктурных систем для транспорта лекарственных препаратов на основе смеси тритерпеноидов бересты, страница 6

Кроме того, эффективность трансфекции генов с помощьюлипосом сильно зависит от состава липидов, соотношения липида/ДНК, размера частицкомплекса липосом-ДНК и используемых клеточных линий. Они могут быть получены сопределенными физико-химическими свойствами, такими как размер, форма и поверхностныйзаряд, который, в свою очередь, определяют стабильность, распределение и поглощение ДНКв экспериментах in vivo [54].абвРис.

20. Структуры: а - диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOPE); катионные липиды: б - 1,2-диолеоил-3триметиламмоний-пропан (DOTAP); в - хлорид N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N триметиламмония(DOTMA).С целью увеличения уровня экспрессии хлорамфеникол-ацетил трансферазы (ХAT) илилюциферазы в клетках печени крыс, в исследовании [55] были использованы катионные,нейтральные и анионные липосомы с различным соотношением ДНК и полиэтиленимина(рис.

21) в составе. Также в состав композиции был добавлен галактоцереброзид длянацеливания на асиалогликопротеиновые рецепторы гепатоцитов. Использование всех29липосомальных композиций приводило к повышению эффективности трансфекции изначительно более низкому уровню токсичности по сравнению с липосомальнымикомплексами без полиэтиленимина.

Эти липосомы являются потенциальными системамидоставки in vivo в гепатоциты.Рис. 21. Структура разветвлённого полиэтиленимина.В работе [56] Kawaura и соавт.изучали эффект моносиалоганглиозида (GM1),включенного в катионные липосомы, содержащие производные катионного холестерина наповерхностидляопосредованнойтрансфекциигеноввкультуральныеклеткимлекопитающих. В работе использовали два различных производных холестерина, а имено:производные, содержащие гидрофобный (рис. 22а) и гидрофильный аминокислотный (рис.22б) остаток соответственно.

Было обнаружено, что катионные липосомы, содержающиетакиепроизводныекатионного холестеринаспособствовали трансфекции плазмид(люциферазы pGL3) в клетки HeLa и CHO-K1 более эффективно по сравнению сконтрольнымикатионнымилипосомамибезмоносиалоганглиозида.Конфокальнаяфлуоресцентная микроскопия также показала, что трансфекция ДНК в составе комплекса слипосомамивклетки-мишенибылаболееэффективнойпридобавлениимоносиалоганглиозида в липосомы по сравнению с липосомами без моносиалоганглиозида.абРис. 22. Структуры производных холестерина, имеющих положительно заряженную головную группу [56]: а производное с гидрофобным аминокислотным остатком ; б - производное с гидрофильным аминокислотнымостатком.Липосомы,состоящиеизхлоридаO,O'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмониоацетил)-диэтаноламина (DC-6-14) (рис.

23), используемого в качествекатионного липида и холестерина показали эффективную активность трансфекции генов в30культуральные клетки. Комплекс липосом - ДНК - (DC-6-14) обычно имеет положительныйповерхностный заряд. Однако, в зависимости от содержания ДНК в липосомах, ζ-потенциалполучаемых комплексов может быть отрицательным. Поверхностный заряд этих липосомопределяет их биораспределение: положительно заряженные комплексы накапливаютсянепосредственно в легких, в то время как для отрицательно заряженных комплексов такоенакопление не наблюдалось. Таким образом, модификация поверхности липосом помогаетулучшить биораспределение, а также их специфическую направленность [57].Рис. 23.

Структура хлорида O,O'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмониоацетил)-диэтаноламина (DC-6-14).Значительное вниманиев последнее время уделяется изучению липосомальныхструктур для доставки малых интерферирующих РНК (миРНК). Липосомальные структурына основе катионных липидов, таких как 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана (DOTAP)(рис.20б) и DOTMA были успешно использованы в качестве систем для доставки миРНК[58]. Комплексы катионных липидов и миРНК получили название “липоплекс”. Липоплексыпроникают в клетки в процессе эндоцитоза или путем их слияния с клеточной мембраной, ивысвобождают миРНК в цитозоль [59].Катионные липосомы, обогащенные производным холестерина оксипропан-1-амином(COPA) (рис.

24а) были использованы для доставки миРНК [60]. Использование такихлипосом позволило повысить эффективность доставки миРНК по сравнению с липосомами,состоящимииз обычногохолестерина.Былаполученаииспользована катионнаялипосомальная структура, формирующаяся на основе различных молярных соотношенийсмеси N1-холестериноксикарбонил-3,7-диазанононан-1,9-диамина(CDAN) (рис. 24б) ивспомогательного липида DOPE для оценки внутриклеточной доставки миРНК для даунрегуляции гена, кодирующего β-галактозидазу [61]. Липосомы CDAN/DOPE/миРНК оказалисьнетоксичны по отношению к клеткам млекопитающих, при этом внутриклеточное поглощениетаких конструкций изначально оказалось медленным, но в последствииувеличивалось.31значительноабРис.

24. Структуры положительно заряженных производных холестерина [60-61]: а – холестерин оксипропан -1амин (COPA); б - N1-холестериноксикарбонил-3,7-диазанононан-1,9-диамин (CDAN).Другая целевая катионная липосомальная структура для доставки миРНК также быларазработана в исследовании [62]. Так, авторами были полученыгалактозилированныекатионные липосомы (GCLs) для адресной доставки миРНК и подавлении активностиэндогенного гена UBC-13 в печеночных клетках карциномы. Результаты испытаний in vivoпоказали дозозависимость от содержания GCLs: активность эндогенного гена была подавленадо 60% в печени по сравнению ссистемой обычных липосом/миРНК, для которой ненаблюдалось подавление активности гена.

GCLs не повышали уровень ферментов печени ибыли нетоксичны в тканях. Однако, несмотря на то, что система доставки GCLs направлена впечень, в эксперименте наблюдалось ее накопление также в легких и почках, вероятно, из закатионного характера липосом (дзета-потенциал был равен +45 мВ).В работе [63] Chang и соавт. разработали липосомальную катионную структуру наоснове DOTAP и DOPE с инкапсулированной миРНК против позитивного рака молочнойжелезыHER2.ОнииспользовалиTfRscFv(одноцепочечныйфрагментантитела,направленный на рецептор трансферрина) для нацеливания липосом к рецепторамтрансферрина, которые, как правило, присутствуют в раковых клетках. Для повышенияустойчивости миРНК была использована двухцепочечная молекула «siHybrids», состоящая изнемодифицированной одноцепочечной РНК и немодифицированной одноцепочечной ДНК.Кроме того, небольшой линейный рН-чувствительный пептид был присоединен к поверхностилипосомдляэффективноговнутриклеточноговысвобождениямиРНК.Результатыэксперимента in vivo показали, что такая липосомальная система может транспортироватьмолекулы миРНК в опухоли (простата, поджелудочная железа, меланома) у мышей, а такжеэффективно подавлять рост НЕR2-позитивных опухолей.32Несмотря на широкое использование катионных липосомальныхструктур длятранспорта миРНК, такие структуры имеют определенные недостатки.

Например, чрезмерноеэлектростатическое взаимодействие между миРНК и катионными липосомами приводит кнестабильности систем и вызывает ферментативную или физическую деградацию. Причёмкатионныелипосомымогутвзаимодействоватьсбелкамисывороткикрови,липопротеинами, и внеклеточным матриксом с возможными высвобождением миРНК.Катионные липиды активируют систему комплемента и подвергаются быстрому выведениюcистемоймононуклеарныхфагоцитов.Формированиеактивныхпромежуточных форм кислорода при использовании катионных липосом также являетсяпричиной токсичности в организме [58].Для того, чтобы избежать вышеуказанные недостатки, было предложено использованиенейтральных липосом. Нейтральные липосомы снижают токсичность, увеличивают времяциркуляции в кровотокеи уменьшают взаимодействие с белками [64]. Недавно былиразработаны липосомы на основе 1,2 -диолеоил -sn-глицеро -3-фосфохолина (DOPC) (рис.

25)со средним диаметром65 нм для транспорта миРНК [65-69].липосомами (на основе DOPC) показалиИспытания in vitro сотсутствии токсичности на фибробластах,кроветворных клетках и клетках костного мозга [58]. Нейтральные липосомы по сравнениюс катионными липосомами (на основе DOTAP) могут транспортировать миРНК в 10 - 30 разболее эффективно [70]. Кроме того, испытания in vivo в исследованиях [65-69] показали, чтолипосомы на основе DOPC при комбинировании с миРНК (150 мг/кг в день) эффективнопонижали регуляцию генов мишеней для белков, таких как EphA2, нейропилин 2, IL-8, Bcl-2,а также уменьшали размеры ортотопических опухолей.Рис. 25. Структура 1,2-диолеоил-sn-глицеро- 3-фосфохолина (DOPC).Многочисленные усилия также были приложены для получения анионных липосом сцелью доставки миРНК. Основной целью являлось уменьшение или полное устранениенеспецифических взаимодействийиспользованиивсыворотке,которые обычнонаблюдаются прикатионных липосом.

Тем не менее, использование анионных липосомхарактеризуется низкой эффективностью инкапсуляции миРНК и33низким клеточнымпоглощением, что снижает эффективность. Недавно в исследовании [71] Kapoor и соавт.сообщили о создании анионной липосомальной структуры, состоящей из смеси 1,2-диолеоилsn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерина) (DOPG) (рис.

26) и DOPE в молярном соотношении40:60 для доставки миРНК. МолекулымиРНК были соединены с липосомами черезкальциевые мостики. Анионные липосомы оказались нетоксичными и значительностабильными в сыворотке крови. Таким образом, анионные липосомы следует рассматриватьв качестве безопасной альтернативы катионным липосомам при доставке миРНК.Рис.

26. Структура 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерина)] (DOPG) (соль натрия).Недавно были разработаны и использованы стабильные частицы нуклеиновая кислоталипид (Stable nucleic acid lipid particles - SNALPs) для системной доставки миРНК [72]. Висследованиях [73, 74] подобные липосомы с диаметром 100 нм были получены путемслияния ионизируемых и катионных липидов, холестерина и ПЭГ-модифицированныхлипидов. Состав этих липидных компонентов может быть скорректирован в соответствии сконкретным исследованием. Полезность SNALPs для доставки миРНК была впервыепродемонстрирована в экспериментах на мышах, зараженных вирусом гепатита B (HBVинфекция) [75]. После этого SNALPs были скомбинированы с миРНК против клеточногоцикла белков Plk1 в терапии рака [76].