Автореферат (Разработка методики и технических средств анализа нанообъектов на примере патогенных микроорганизмов в питьевой воде), страница 3

Разработана лабораторная установка как для регистрации спектров внеподвижной воде, так и для определения динамических параметров спектральныххарактеристикобъектов микробиологии.4. Разработанаметодика обработки результатов измерений иоценки доверительныхграниц, а также методикааппроксимацииспектральных распределенийрассеянногоизлучения.Рис. 1. Спектр излучения лазера с длиной волны λ1=810нм, прошедшего раствор кишечной палочки E.coli9Статистическая обработка результатов измерений производится в соответствии со стандартизованными методиками. В основу методики распознания патогенных микроорганизмов заложен метод, основанный на сравнении параметровисследуемых растворов со стандартными образцами в пределах погрешности сдостоверностью определяемой стандартными методами.Разработанный метод основан на исследовании нелинейных эффектов,связанных с взаимодействием вынужденной люминесценции ДНК под воздействием излучения лазера и самого лазерного излучения.

Анализ эффектов показал, что для идентификации патогенных микроорганизмов необходимо использовать следующие типовые параметры:1. Количество максимумов спектральных распределений, соответствующих рассеянному патогенной ДНК излучения;2. Разница между центральной модой лазера и максимумами распределений Лоренца, выделенных из спектра патогена;3. Положение относительно лазерной моды (стоксовое или антистоксовоераспределение).Для подтверждения работоспособности метода в условиях длительной непрерывной эксплуатации было смоделировано действие дополнительной погрешности, вызванной расслоением моды лазерного источника, вследствие нагрева излучателя (Рис.

2). Как видно, несмотря на разделение лазерной моды на две составляющие Mkr1 и Mkr2, резонансное излучение происходит на частотах (Mkr3,Mkr4), равноотстоящихот соответствующих имчастот накачки. Дисперсия по данному параметру не превышает ±0,55нм, что также подтверждает возможность использования разности частот в качестве наиболеестабильногоинформативного параметра дляавтоматического онлайнмониторинга.Рис.

2. Спектр рассеяния для раствора кишечной палочки: 1,2 – максимумы, соответствующие источнику излучения; 3,4 – соответствующие люминесценции патогена10Однако выбранные параметры статические и их недостаточно для определения жизнеспособности микроорганизма, поскольку мертвые клетки не имеютлюминесценции, а ВРМБ порог достигается за счет выкачивания энергии из лазерной моды. Это явление не является однозначным, так как выкачивание энергиииз лазерной моды существует и для различных типов патогенов.

Для определенияналичия не только активных, но и инактивированных патогенов необходимо переходить в динамический режим (запись спектральных характеристик без усреднения), что предъявляет дополнительные требования к программному обеспечению обработки спектральных распределений. Исходя из анализа базы данных полученной динамической модели, погрешность разности длин волн возбуждающего и рассеянного излучений не превышает 0,052 нм.Анализ показал, что в качестве аппроксимирующей спектральные распределения функции наилучшие результаты показало представление смеси нормированных распределений интенсивности при уширении гауссова и лоренцевскоготипов:(−)( ) = ((1 − ) exp (Г 2(2 )2) + Г( )22Г(−)2 +( )22),(2)где x – интенсивность излучения, p – интенсивность стоксовой или антистоксовойсоставляющей, Г – параметр ширины спектральной линии, α – параметр, определяющий вклад лоренцева уширения в искомое распределение, при этом, если α=0– имеем чистое уширение гаусса, α=1 – уширение лоренцевского типа.В четвертой главе обоснован выбор критериев обнаружения патогенныхмикроорганизмов в питьевой воде и определены информативные параметры спектральных распределений.На основе серии теоретических и экспериментальных исследований проведено статистическое исследование водопроводной воды и показано, что интенсивность шумов невелика по сравнению с интенсивностью лазера, и растворенные примеси не имеют дополнительных максимумов в диапазоне 870-1120 нм.Определены величины статистических поправок, необходимые для разработкипрограммы создания стандартных образцов распределений.

Среднеквадратичноеотклонение величины сигнал/шум не превышает 0,5 дБ. Погрешность максимумадлины волны основной лазерной моды не превышает 0.03% и может не учитываться при создании стандартных образцов.Проведены исследования спектральных характеристик ряда типов патогенных организмов (Таблица 1) в питьевой воде в количестве, необходимом дляпервоначального распознавания типа патогенных микроорганизмов с доверительной вероятностью 0.95, заданной регламентированными требованиями контроляданных показателей.11Показано, что в случае создания стандартного образца по спектральнымраспределениям ВРМБ надо рассматривать области излучения лазера и люминесценции объекта. Для контроля другого типа патогенных микроорганизмов необходимо и достаточно произвести регистрацию его спектральных характеристик,добавление нового стандартного образца производится автоматически.Таблица 1.Список идентифицируемых патогенных микроорганизмовБактерии – 17 типовCampylobacter jejuniChlamydia psittaciChlamydia trachomatisEnterococcusHelicobacter pyloriM.

tuberculosis hominisM. tuberculosis aviumM. tuberculosis bovisВирусы – 10 типовHuman herpes virus type IHuman herpes virus type IIVirus herpes Varicela-zosterEpstein-Barr virusCytomegalovirusHepatitis virus АHepatitis virus ВHepatitis virus С genotype 1ВMycoplasma hominisNeisseria gonorheaeNeisseria meningitidesPeptostreptococcus anaerobiusProteus mirabilisHepatitis deltaHuman Immunodeficiency VirusГрибы и паразиты – 4 типаCandida albicansВ результате анализа динамики возникновения и затухания резонанснойлюминесценции патогенных микроорганизмов были выделены корреляция обнаружения сигнала по времени и дрейф частот спектральных линий, разработан алгоритм распознавания спектров, присущих патогенным возбудителям. Исходя изскорости реакции сигнала на наличие в исследуемом растворе патогенных возбудителей и времени жизни облучаемых возбудителей, временной интервал анализапатогенности состава для предупреждения возможности ошибки второго родаможет устанавливаться от 75 секунд до 8 минут.ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕРезультатами диссертационной работы являются:1.

Подтверждена возможность применения лазерного метода для контроля патогенных микроорганизмов, позволяющего производить мониторингнепосредственно в водопроводном потоке в режиме реального времени.122. Впервые представлена рабочая методика не нарушающего состав контроля питьевой воды, дающая возможность непрерывного проведения измерений,обработки результатов и анализа патогенности состава коллоидного растворанепосредственно в водопроводном потоке, что решает задачу автоматизацииизмерений и таким образом выводит качество метрологического обеспечения всего процесса на новый уровень.3. Разработан математический аппарат распознавания образов, позволяющий определять наличие активных патогенных возбудителей, несмотря наналичие в растворе инактивированных клеток патогенных микроорганизмов.

Показано, что величина информативного параметра (инвариантности частот основной лазерной моды и максимума резонансной линии рассеяния патогенными микроорганизмами) остается в пределах допуска 0,05 нм.4. Впервые представлено достижение пороговых мощностей возникновения ВРМБ патогенных микроорганизмов, перечисленных в Таблице 1, что позволило разработать метрологические требования к опытному образцу прибора,позволяющему на основе оценки характеристик рассеянного излучения обнаруживать в питьевой воде присутствие данных микроорганизмов. Минимальнаямощность лазерного источника для достижения порогового эффекта 270 мВт.5.

Представлен опытный образец прибора, позволяющий производитьмониторинг объектов микробиологии в питьевой воде с доверительной вероятностью 0.95, регламентированной для данного контроля. Для идентификации патогенных возбудителей для которых не содержится стандартных образцов в базепрограммного комплекса необходимо провести регистрацию спектральных характеристик интересующего типа патогена, после чего стандартный образец добавляется в базу данных и последовательно выделяется из общей картины спектральных распределений в диапазоне 800-1370 нм, и далее может быть использован дляавтоматического мониторинга содержания данного патогенного микроорганизма.База данных программного обеспечения прибора содержит стандартные образцыспектральных распределений для более 70 штаммов различных типов объектовмикробиологии (Таблица 1).6. В результате выполненного в диссертации анализа выявлена, какпредполагается, возможность не только детектирования в составе воды патогенных микроорганизмов, но и вычисления типа обнаруженных микроорганизмов сточностью до штамма.7.

Работоспособность разработанных методики и технических средствреализации предложенного метода подтверждена также для наноразмерныхструктур небиологического происхождения – частиц наносеребра. В Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сель13скохозяйственных наук» при проведении исследований антибактериальныхсвойств авиационных деталей, изготовленных из специальной резины с вкраплениями частиц наносеребра, контроль содержания данных частиц и измерение ихконцентрации проводились с применением лазерного метода, разработанного вдиссертации.8.