Диссертация (Разработка метода расчета рабочих процессов и создание пневмовакуумной установки сепарации ДНК), страница 6

Время цикла выделения составляетот 30 до 45 минут в зависимости от типа выделяемого материала. Также вустановке имеется возможность программирования протоколов выделения.32Размеры установки: длина 530 мм, ширина 370 мм, высота 380 мм при массе в20 кг.Рисунок 1.6. Установка 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems)Недостаткамиустановкиявляетсяотсутствиевозможностииспользования планшетов очистки с разным количеством ячеек и применениемножества ручных операций при работе.Известны отдельные блоки вакуумной сепарации – рабочие полости дляоткачки.

Их можно использовать с планшетами очистки различных форматовпо количеству ячеек. Среди таких блоков сепарации можно выделить ArrayItHigh-Capacity Vacuum Manifold (Рисунок 1.7) компании Arrayit Corporation.Недостатком отдельных блоков сепарации является то, что они не имеютвстроенных систем откачки и представляют собой вакуумную камеру сэлементами соединения с внешним вакуумным насосом.

Общим недостаткомсуществующихустановок,предназначенныхдлявакуумнойсепарации,является неравномерность протеканиярабочих процессов в ячейках планшетовочистки.Рисунок 1.7. Блок вакуумной сепарации ArrayIt High-Capacity VacuumManifold (Arrayit Corporation)33Патентный обзор установок вакуумной сепарации выявил аналог блокавакуумной сепарации – Multifunctional vacuum manifold (Рисунок 1.8) [18;19].Конструкция данной установки представляет собой несколько вертикальносоединенных элементов корпуса с вакуумируемой областью, между которыминаходятся уплотнения.

Внутри корпуса размещаются элементы с 96 рабочимиячейками, предназначенными для проведения процесса сепарации и сбораочищенных растворов с пробами. В конструкции имеется несколько сменныхэлементов различного назначения.Рисунок 1.8. Блок вакуумной сепарации Multifunctional vacuum manifoldОсновным недостатком рассмотренной УВС является то, что ееконструкция содержит множество элементов, которые необходимо вручнуюперемещать (собирать и разбирать) для создания работоспособности изделия.Это приводит к потере времени на вспомогательные действия лаборанта.Другим недостатком указанной установки следует отметить необходимость вприменении вакуумной системы откачки для создания перепада давлениямежду верхней и нижней поверхностями рабочих ячеек.В качестве ближайших аналогов УВС необходимо выделить промывателидля микропланшетов. Существует промыватель микропланшетов Hydroflex(Рисунок 1.9) компании Tecan.

Он имеет автоматическую 8-ми или 16-тиканальную головку для одновременной промывки 8-ми или 16-ти ячеек.34Имеетсяавтоматическаясистемавакуумнойсепарации,оснащеннаяспециальной бутылью для отходов, клапаном отбора воздуха и особой кареткойдля установки планшетов очистки. Недостатками данной УВС являютсяперебои с работой вакуумной откачки, особенно при длительном простоеустановки. Имеются проблемы при вакуумной прокачке растворов разнойвязкости.Рисунок 1.9. Установка Hydroflex (Tecan).БлизкиманалогомУВСявляетсяавтоматическийпромывательStatFax2600 (Awareness-USA) и ручной промыватель Starwash (Awareness-USA)(Рисунок1.10).Изустановокроссийскогопроизводстваизвестныавтоматические раскапыватели, такие как Проплан (Пикон - Россия) (Рисунок1.11).

Однако данные установки используются в качестве заменителя ручныхоперацийраскапыванияиммуноферментногорастворов,анализа,нонепредназначеныпроизводятдлявыделенияпроведенияДНК.Насегодняшний день не имеется полноценных аналогов УВС российскогопроизводства, существуют лишь промыватели, блоки вакуумной сепарации исистемы откачки, применяемые отдельно.Представленные установки имеют системы дозирования и раскапывания,однако не лишены проблемы неравномерности протекания рабочих процессов вблоках выделения, вероятности потери исходного материала, что в дальнейшемприведет к недостоверности молекулярных исследований.35Рисунок 1.10.

Установка StatFax2600 (Awareness) и ручной промывательStarwashРисунок 1.11. Установка Проплан (Пикон)Таким образом, необходимо разработать установку вакуумной сепарацииДНК,котораяпозволитпроводитьподготовкупробкмолекулярно-биологическим исследованиям с достаточной степенью очистки и будетотличаться от существующих установок равномерностью протекания рабочихпроцессов, что позволит получить стабильность качества очищаемых растворовДНК. Разрабатываемая УВС предназначена для малых медико-диагностическихлабораторий, которые имеют небольшой поток исследований в день. Поэтомуданная установка планируется полуавтоматической с использованием ручныхопераций.361.4.ПриОсновные параметры установок вакуумной сепарации.пробоподготовкебиологическихобразцоввысокомолекулярныхДНКкструктурустройствамсцельювыделенияобеспеченияэффективности их работы предъявляются высокие требования.

Необходимовыделитьнесколькопараметровифункциональныххарактеристик,определяющих эффективную работу установок вакуумной сепарации ДНКрастворов:1.Возможность выделения искомого биоматериала из проб различнойприроды.2.Время одного цикла пробоподготовки не должно превышать 40 мин.3.Количественная потеря исходного материала ДНК не должна превышать50 %.4.Возможность подготовки различного количества проб.5.Количество ингибиторов ПЦР после цикла пробоподготовки должноуменьшитьсядоуровняконцентрации,прикоторойПЦРвозможноосуществить.6.Возможностьприменениятиповых96-луночныхпланшетовдлявыделения.7.Возможность управления рабочим процессом сепарации – скоростьюоткачки рабочей полости УВС.8.Отсутствие кросс-контаминации образцов при подготовке проб.9.Получение подготовленной пробы из минимальных количеств исходногообразца.10.Мобильность установки, пониженные массо-габаритные показатели.11.Максимальная автоматизация процесса пробоподготовки.12.Минимальные затраты на саму установку, эксплуатацию и расходныематериалы.Для реализации данных требований к УВС необходимо решитьважнейшие задачи:371.Обеспечить максимально быструю промывку рабочих ячеек, при этомсохраняя эффективность связывания ДНК на пористом теле.2.Обеспечить возможность подготовки растворов разной плотности иконсистенции в любых ячейках, также при наличии незаполненных ячеек.3.Создать вакуумную систему с управлением быстротой откачки.4.Дляснижениявероятностиконтаминацииобразцовисключитьвозможность попадания раствора из выхода одной ячейки в другую.5.Обеспечить наиболее полное отделение ДНК от пористого тела дляисключения потерь образца в рабочей области, повышения выхода продукта.Это позволит подготавливать пробы с минимальным количеством исходногоДНК.6.Создаваемая УВС должна быть мобильной, иметь минимальные массу игабариты.7.Создаваемая УВС должна быть максимально простой в эксплуатации.1.5.Обзор методов расчета рабочих процессов, протекающих вустановках вакуумной сепарации.Принцип действия установок вакуумной сепарации основан на том, чтораствор ДНК (исходный раствор)проходит через рабочие ячейки в блокевакуумной сепарации и молекулы ДНК осаждаются на пористом теле [111].Рабочая ячейка представляет собой микропробирку с отверстием в ее нижнейчасти.

Внутри ячейки располагается пористое тело. Ячейки объединяются ведином устройстве – планшете очистки. Планшеты очистки стандартизованы ивыполняются преимущественно в 96-луночном и 384-луночном форматах (96 и384 ячейки соответственно). Несколько типовых 96-луночных планшетовочистки для выделения ДНК представлены на Рисунке 1.12.При детальном рассмотрении рабочего цикла в УВС имеет местонесколько одновременно протекающих физических процессов.

Это процесстечения рабочей среды в ячейках планшета очистки и процесс связывания ДНКна поверхности пористого тела (материала на основе диоксида кремния в виде38порошка или прессованных волокон). Рабочей средой в УВС является смесьжидкой фазы (раствора) и газовой фазы (воздуха).Рисунок 1.12. Типовые 96-луночные планшеты очистки фирмы «Orochem»Процесс течения рабочей среды происходит под действием перепададавления и приводит к движению исходного раствора из начального положенияв верхней части ячейки в пространство, заполненное пористым телом.

В данномслучае рабочую область внутри УВС необходимо разделить на несколькочастей: объем заполненных ячеек над пористыми телами 1, область пористыхтел 2, объем ячеек под пористыми телами 3, полость откачки 4 и вакуумныйтракт до насоса 5. На Рисунке 1.13 показан вырезанный фрагмент рабочейобласти типовой УВС с 4-мя ячейками. В области 1 показано начальноезаполнение ячейки рабочей средой – часть области имеет более контрастныйцвет (Рисунок 1.13).В области 1 происходит движение рабочей среды с малыми скоростями,котороеописываетсяклассическимиуравнениямиуравнениями движения рабочей среды Навье-Стокса.гидродинамики–39Рисунок 1.13.

Фрагмент рабочей области с 4-мя ячейками планшета очисткиВ области рабочего процесса связывания – области пористых тел 2 –происходит течение через микроканалы, образованные развитой поверхностьючастиц силики. Изучение движения жидкостей и газов через пористые средыбыло очень актуально многие годы в связи с применением моделей описанияподобных процессов применительно к нефтедобывающей промышленности.Течение рабочей среды в пористых телах можно описать с помощью различныхмоделей, разработкой которых занимались многие исследователи, такие какДарси, Маскет, Лейбензон, Форхгеймер, Гаген, Пуазейль, Козени, Карман и др[21]. Описание движения рабочей среды в области пористых тел 2 может бытьпредставлено моделями течения через пористые тела.В областях 3, 4 и 5 течение рабочей среды обусловлено действиемперепада давлений.