Диссертация (Разработка метода расчета рабочих процессов и создание пневмовакуумной установки сепарации ДНК), страница 5

Недостатки метода: повышенная стоимость посравнению с ручными методами; пригодность только для образцов жидкоготипа; количество ДНК, имеющееся на карте, невозможно подвергнутьколичественномуанализуилискорректировать;можетпотребоватьсяизменение протокола амплификации с целью введения поправки на объем ДНКна бумажном фильтре.Сорбционная экстракция – метод, в основе которого лежит избирательнаясорбция на поверхности силики (диоксида кремния SiO2) в присутствиехаотропной соли. В первую очередь в раствор добавляются хаотропные соли идетергенты, способствующие лизису клеток и высвобождению НК.

Далее приусловии высокой концентрации хаотропных агентов (хаотропных солей) НКсвязываются с поверхностью силики. Для отделения силики со связанной ДНКот остального раствора применяется несколько методов: разделение вгравитационном поле (центрифугирование и последующие промывки судалениемнадсадочнойжидкости),вакуумнаясепарация(удалениенадсадочной жидкости при перемещении ДНК-раствора через пористое телопод действием перепада давления), сепарация на магнитных частицах(удержание ДНК на магнитных частицах, перемешивание и удалениенадсадочной жидкости забором из раствора с применением несколькихпромывок.) После получения раствора хаотропных солей и ДНК без примесейон промывается 70 % спиртовым раствором для удаления хаотропных солей(ХС). НК при снижении концентрации ХС элюирует (высвобождается споверхности силики) и переходит в готовый раствор.

Метод сорбционнойэкстракции позволяет эффективно выделять НК как из стандартных объемовклинического материала, так и из больших объемов биопроб – от 1 мл и более,26приэтомнетребуетсядополнительныхстадийконцентрированиябиологического материала. Данный метод подходит как для молекулярногенетических исследований, так и для обнаружения различных инфекций смаксимальной чувствительностью. Сорбционный метод позволяет качественноотмывать образец от всевозможных примесей, ингибиторов, которые могутпривестикухудшениюреакции.Благодаряэтомуметодявляетсяуниверсальным – он подходит для любых типов биопроб.Экстракция на пористом теле производится с помощью добавления висходный раствор хаотропного агента (например, гуанидинтиоцианата), чтоприводит к денатурации белков и создает условия для связывания ДНК счастицами силики.

ДНК и РНК связываются на стекловолоконном материале(Qiagen, Hilden; Macherey-Nagel, Düren) в присутствии высокой концентрацииХС. Осаждение основывается на селективном отделении гидратных оболочекНК. Белки и полисахариды остаются при этом свободными от влияния.Связанный материал в заключение промывается спиртовым раствором и послеосушениявбуфереСтекловолоконныйнизкойматериалсолевойпредставляетконцентрацииоптимальнуюэлюирует.основудляреализации метода автоматизированной экстракции нуклеиновых кислот, т.к.общий процесс сводится к связыванию, промывке и элюции, котораяпоставляет продукт высокой концентрации и чистоты, необходимой для многихдальнейших операций. Преимущества данного метода: быстрота выполнения;простота исполнения; экономичный; исключает наличие ингибиторов; можноавтоматизировать. Недостаток – сложно выделять ДНК из объектов с малымколичеством биологического материала.Одним из наиболее распространенных и эффективных методов являетсяметод экстракции с помощью магнитных частиц.

В этом случае к исходномураствору добавляются мельчайшие магнитные шарики, покрытые силикой. ПриповышенииконцентрациихаотропныхагентовДНКсвязываютсясповерхностью силики, а благодаря действию магнитного поля шарики можноперемещать и отделять от исходного раствора с ингибиторами. После27нескольких отмывок в растворе снижается концентрация ХС и ДНК элюируют.Преимущества метода: увеличенная емкость сорбента, связывающего большиеколичества ДНК; минимизация потерь в ходе выделения (нет необходимостиосаждения); уменьшение риска перекрестной контаминации за счет того, чтопрактически все НК связываются сорбентом; возможность масштабированияметодики выделения; высокая чистота конечного продукта.

Основнымнедостатком метода является его дороговизна.Метод выделения ДНК с помощью экспресс-экстракции на основетемпературного лизиса не слишком распространен из-за низкой эффективностиочистки. Исходный раствор с лизирующим буфером подвергается термическойобработке, после которой разрушаются клетки и НК переходят в раствор. Послецентрифугированиянадсадочная жидкость снимается и используется какреагент для ПЦР. Основным недостатком данного метода является низкоекачество очистки полученного раствора, т.к. в нем имеется множество белков–ингибиторов ПЦР. Вследствие этого биологическими образцами могут являтьсятолько те, в которых присутствует малое количество ингибиторов (достаточночистые пробы).

Чувствительность данного метода невысока, однако, он самыйбыстрый и экономичный. Данный метод используется широко, но длякачественной оценки. Основное его применение – в молекулярно-генетическихлабораториях.Проведенный анализ вышеописанных методов позволил сделать вывод,что наиболее перспективным является сорбционный метод, при котороммолекулы ДНК осаждаются на пористом теле. Данный метод позволяетполучить высокую степень очистки получаемой пробы, в тоже времяосуществить рабочий процесс за небольшой промежуток времени длямножества проб одновременно. Процесс применения данного метода не требуетсложных операций и может быть автоматизирован.

Сорбционный метод,основанный на осаждении ДНК на пористом теле с помощью перемещенияисходного раствора под действием перепада давлений, называется методом28вакуумнойсепарации.Этотметодпринимаетсядляреализациивпневмовакуумной установке сепарации ДНК.1.3.Обзор оборудования для пробоподготовки.В настоящее время в мире выпускаются установки, принцип действиякоторых основан на сорбционном методе.

Основными производителямиявляются США, Япония, Германия. В общем случае оборудование дляпробоподготовки включает в себя автоматизированные установки, в которыхперенос растворов с пробами и другие рабочие операции осуществляются сприменением роботизированных манипуляторов, и неавтоматизированные, вкоторых операции производятся в большей степени с помощью действийлаборанта (ручных операций).1.3.1. Автоматизированные установки пробоподготовкиНа сегодняшний день имеется множество функционирующих станцийпромышленного выделения ДНК [20].

Это разработки таких ведущихкомпаний, как Tecan (станция Freedom EVO), Abbott Molecular (m2000sp)(Рисунок 1.1), Dornier-LTF (Германия, станция PIRO), Eppendorf (epMotion 5075VAC) и др.Рисунок 1.1. Установка m2000sp (Abbott Molecular)Автоматизированное оборудование пробоподготовки в большей степениосновано на методе магнитных частиц из-за того, что МВС имеет недостаткомприавтоматизацииотсутствиестабильностикачестваочистки29биомолекулярных проб.Имеется несколько аналогов автоматизированныхустановок пробоподготовки, работающих на сорбционном методе осажденияДНК на магнитных частицах. Например, созданная в Германии системавыделения:InnuPure®C16(AnalytikJena)(Рисунок1.2).Установкапредставляет собой пластичную и эффективную систему экстракции дляполностью автоматизированного выделения и очищения нуклеиновых кислот.В данной установке предусмотрен предварительный этап лизиса клеток врастворе.

Использование магнитных частиц сводит риск кросс-контаминации кминимуму. Имеется возможность обработки 16 образцов одновременно, атакже программное управление протоколами. Время одного цикла очисткисоставляет около 40 минут. Имеется возможность очистки различных типовисходных образцов. Образцы могут подогреваться до плюс 70 °C. Размерыустановки: длина 530 мм, ширина 370 мм, высота 380 мм, а масса примерно 28кг.Рисунок 1.2. Установка InnuPure C16 (Analytik Jena)Из установок, работающих на принципе магнитных частиц можновыделить также автоматизированную систему Arrow (Рисунок 1.3) компанииNorDiag (длина 465 мм, ширина 445 мм, высота 442 мм, весом 22 кг, до 12образцов, время выделения 30 мин.) и процессор магнитных частиц KingFisher(Рисунок 1.4) (Thermo Scientific) (длина 310 мм, ширина 290 мм, высота 290 мм,весом 10 кг, 24 образца, для 96 луночных планшетов очистки, без нагреварастворов, программы протоколов имеются)30Рисунок 1.3.

Установка Arrow (NorDiag)Рисунок 1.4. Установка KingFisherFlex (Thermo Scientific)В настоящее время имеются и аналоги установок сепарации ДНКяпонского производителя Kurabo, такие как QuickGene-810 (Рисунок 1.5) (длина448 мм, ширина 398 мм, высота 332 мм, 24 кг, время цикла выделения от 15 до20 минут).Рисунок 1.5.

Установка QuickGene-810 (Kurabo)31Представленные аналоги применяются в диагностических лабораторияхкрупных медицинских учреждений, а также в больших исследовательскихкомплексах. Однако их применение связано со значительными объемамисредств, которые необходимо привлечь для покупки как самих дорогостоящихустановок, так и не менее дорогостоящего расходного материала. Для малыхлабораторий, а также диагностических отделов мелких стационаров, напримертуберкулезных диспансеров, требуются недорогие, компактные, мобильные ипростые в обслуживании и эксплуатации установки выделения ДНК,предназначенные для быстрой и эффективной пробоподготовки. В сфересиловых структур требуются установки, которые возможно применить вполевых условиях. Поэтому актуальной задачей является разработка не толькокрупного автоматизированного оборудования, но и небольших установок,предназначенных для подготовки небольшого количества проб.1.3.2.

Неавтоматизированные установки пробоподготовкиНа сегодняшний день известны установки вакуумной сепарации,позволяющие выделять ДНК с помощью осаждения их на пористой подложкепутем пропускания раствора через ячейки с использованием вакуумной откачкирабочей полости установки. Например, ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation[17] (Рисунок 1.6). Конструкция данной установки содержит рабочую полость,предназначенную для работы с 96-луночными планшетами очистки идвухпозиционную систему переносаи прижатия планшетов, а такжевакуумную систему, состоящую из вакуумного насоса, колбы-сборника,фильтра и вакуумных шлангов. Установка 6100 Nucleic Acid PrepStation.ABI PRISM 6100 – полуавтоматическая препаративная станция для выделениявысокоочищенных нуклеиновых кислот (общей РНК и геномной ДНК) изразличных источников: цельной крови, клеток крови, опухолей, тканейживотных и растений, клеточных культур.