1631210429-6e37ee16e9132933744a4f4055b3cef5 (Лекция 18 - Аффинная модификация ферментов), страница 2

АР-ДНК специфической структуры могут использоваться для мониторинга уровняэтих белков в клеточных экстрактах.Ilina et al., Biochem Biophys. Acta 2008; Khodyreva et al., PNAS, 2010; Kosova et al. BiochemBiophys. Acta, 2016Ковалентное присоединение белковк АР-участкам (АР-сайтам) в ДНКИдентификация Ku80 из клеток хронической миелоидной лейкемиичеловека как белка, ковалентно присоединенного к ДНК-дуплексу,содержащему апуриновый/апиримидиновый (АР-) сайтбелокбелокKu 80+белок1) АдсорбцияNaBH4ДНК-дуплекс,экстрактсодержащийAP-сайт, биотин ирадиоактивную метку2) Отмывкастабильный комплексДНК–БЕЛОКМодифицированныйбелок1) Элюция с сорбентатрипсинРадиоавтографгеляPARP1Окраска белковкумасси R-250Ku 802) ЭлектрофорезСорбент cиммобилизованнымстрептавидиномМасс-cпектрометрия(MALDI-TOF-MS)Идентификация белка(Mascot/Profound)Роль Ku-антигенаФункции Ku-антигена:•Репарацияразрывов ДНКдвойных•V(D)J-рекомбинация•Репликация ДНК•Регуляция транскрипции•Сохранение теломерныхконцов•Апоптоз•Адгезия клетокKu-антиген как онкобелок или какбелок-супрессор развития ракаАффинная модификациинадмолекулярных структур (рибосомы)(В.

Будкер, А. Гиршович, “Russian field”)ZLXXLS1LS1S1LS1XS2«Природный»комплексS2S2S2Комплекс мишень•аффинный реагентZ – реакционноспособная группа; Х - линкервыборструктуры(L),обеспечивающейспецифичноесвязывание реагента с изучаемым объектом (S);выбор реакционноспособной группы для будущего реагента (Z);выбор способа объединения этих двух структурных элементовв единой молекуле реагента через мостик (X).24Функциональные компонентыаппарата трансляцииГенетический кодАмино- КодонкислотаАргининAGAAGGCGUCGCCGACGGАминокислотаКодонЛейцинCUUCUCCUACUGТирозинUAUUAСМетионинAUGОпределение молекулярного окружения нуклеотидовмРНК на рибосоме человека с помощью аффинноймодификацииИнструменты для изучения мРНК-связывающего центра рибосомчеловека – аналоги мРНК со сшивающей группой на выбранномнуклеотиде или на концевом фосфатеСхематическоеизображениеаналога мРНК.Аналоги имели длину6-12 нуклеотидовКодон Phe5’-конецМетка 32 РUUCN*3’-конецМодифицированныйнуклеотидСтруктурные формулы модифицированных звеньев мРНК(модификации выделены)Достоинство метода фотоаффинной модификации  возможность приготовить реакционнуюсмесь в темноте и лишь после формирования специфических комплексов провести облучение, т.

е. включитьпроцесс модификации в определенное время.Ароматические азиды как функциональные группыдля фотоаффинных реагентовАрилазидные группировки можно возбуждать светом в ближнемультрафиолетовом диапазоне, избегая при этом возбужденияифотохимических реакций самих компонентов исследуемого комплекса.Использование интенсивных источников облучения позволяетпроследить за кинетикой фотоаффинной модификации биополимеров...:NN3hnH N RR=-OR'-NR'2-CR'3-SR'RH-N2X1XX2Механизм фотолиза тетрафторазидобензоильных производныхONF2:ISCNF:N3FO-23Oh-N2H2N41F756O-Аминокислотные остатки белков,подвергшиеся фотоаффинному мечениюарилазидными реагентамиАминокислотныйостатокЧисловыявленийАминокислотныйостатокЧисловыявленийTyr16Asn2Lys13Arg2Trp8Val2Thr5Met2Cys4Leu1Ile3Asp1Pro3His131Арилазиды, по сравнению с карбенгенирирующими соединениями (диазирины, диазосоединения), прифотолизе в гораздо меньшей степени реагируют с водой.NNNN*..CF3CF3CCF3hRRR(2)(1)h-HNN+CCF3(3)R32Такие фотоактивируемые источники карборадикалов, как бензофеноны, при фотолизе даже менеереакционноспособны в отношении воды, чем арилазиды, но они слишком избирательны в отношениимодифицируемых мишеней.

В косметике активно используются солнцезащитные фильтры на основе бензофенона, такие какбензофенон-1, бензофенон-2, бензофенон-3 (оксибензон), бензофенон-4 и другие. Они защищают кожу от широкого спектра УФизлучения.Парфюмерные изделия упаковываются в прозрачные флаконы для того, чтобы создаватьпредставительный вид, но от этого они не достаточно защищены от ультрафиолетового излучения,поэтому в парфюмерные изделия добавляют бензофенон, который дополнительно выполняет функциификсатора запаха.

Сам бензофенон хоть и имеет запах герани и розы, но не принимает активного участияв формировании запаха.Преимущества фотоаффинной модификации при исследовании многокомпонентныхкомплексов, например, репликативного комплексаВозможностьизучениябыстропротекающихизмененийвобластиконтакта участников процесса: ферментов,ДНК-матрицы и dNTP при помощибыстрогофотохимическогомеченияфермента фотоактивируемыми аналогамиdNTP или праймера, которое можноосуществить за миллисекунды, используяимпульсное облучение.Фотоактивируемые группы позволяютопределитьвзаимноерасположениеотдельных субъединиц всех участниковрепликации относительно ДНК и друг другаи исследовать динамику функционированиятаких систем.В случае фотореагентов, содержащихарилазидогруппы, существует возможностьвариациидлинылинкераитипаарилазидогруппы,чтоспособствуетповышениюэффективностииселективности модификации биополимера.Комплекс состоит из белков, раскрывающих структуру ДНК и не дающихцепям воссоединиться, из ДНК-полимераз (α, δ, ε), синтезирующихлидирующую и отстающую цепи в едином комплексе с факторамирепликации, такими как PCNA и RFC, и ДНК-лигаз, восстанавливающиходноцепочечные разрывы.

Важным фактором репликации является RPA,основная функция которого состоит в стабилизации однонитчатых участковДНК после раскрытия ее структуры.Бинарная система фотоаффинных реагентовА) Белок-мишень содержит центрсвязывания для двух субстратов.Б) Образование комплекса белка-мишени срадиоактивно меченым фотореагентом исенсибилизатором.В) Во время облучения энергия изначальнопоглощается сенсибилизатором, а затемпереносится на фотоактивируемую группуреагента.

Реагенты, связанные внеактивного центра и находящиеся врастворе, не возбуждаются.Г) Реагент ковалентно присоединяется всвязывающем центре белка-мишени.Методы высокоселективной модификации ферментов.Каталитически компетентное мечение.А) Белок-мишень содержит центр связывания для двух лигандов.Б) Реагент пришивается к белку-мишени внутри (специфично) ивне (неспецифично) активного центра.В) Ковалентное присоединение радиоактивномеченого субстратак реагенту внутри активного центра.Г) Примеры аффинных реагентов.