1631210429-6e37ee16e9132933744a4f4055b3cef5 (Лекция 18 - Аффинная модификация ферментов)

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ.АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены краснымжирным шрифтом. Предложенные задания в презентации сдать до 1мартаКому недостаточно материала презентации, загляните на стр. учебника Д.Г.Кнорре, Т.С. Годовикова. С.Д. Мызина, О.С. Федорова «Биоорганическаяхимия».

Учебник: Северин «Биохимия».Что нужно знать после лекции.Химическая модификация белков. Подбор химических модифицирующих агентов.Пути повышения селективности химической модификации белков.Общие принципы конструирования аффинных реагентов. Типы реакционноспособных групп ваффинных реагентах. Способы их введения и механизмы модификации. Фотоактивируемыереагенты: перспективы и проблемы.Пути повышения селективности аффинной модификации. Каталитически компетентное мечение.Модификация с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов.Аффинная модификация как инструмент изучения механизма функционирования надмолекулярныхкомплексов. Примеры аффинной модификации в исследованиях репликационного,транскрипционного комплексов и рибосом.Химическая модификация функциональных групп в белкахХимические воздействия на белки инуклеопротеидные комплексы (химическаямодификация), как правило, приводят к потереими функциональной активности, еслимодифицируемые остатки принимают участиев формировании функционально значимыхобластей.

Поэтому химическая модификацияможет служить источником информации оструктурных основах функционированиябиополимеров. В первый период становлениямолекулярной биологии химическаямодификация в ее непосредственном видешироко использовалась для получениясведений о связи функций биополимеров с ихструктурой. Мы с вами познакомились с рядомреагентов, обладающих некоторойспецифичностью к определеннымфункциональным группам белков.Подбор бифункциональных реагентов для модификации белковРеагенты, содержащие две модифицирующие группировки (бифункциональные реагенты), способныприсоединяться к двум сближенным группам в составе одного белка или образовывать ковалентные связи сдвумя молекулами биополимеров, например, с антителом и ферментом. Использование фермента,способного превращать субстрат в окрашенный продукт, обеспечивает регистрацию сигнала послеобразования комплекса антиген-антитело при иммуноферментном анализе.Использование бифункциональных реагентов с «жестким» линкером, специфичных в отношенииаминогрупп, обеспечивает, например, модификацию определенных остатков лизина в белке.Подбор химических модифицирующих агентов для модификации ферментов1.

Высказывается предположение об аминокислотныхостатках, находящихся в активном центре ферментаили интересующем сайте,2. Осуществляется подбор реагентов, специфичных копределенным аминокислотам,3. Исследуется ковалентное присоединение реагента кбелку и стехиометрия присоединения,4.

Определяется уровень инактивации фермента, какследствие химического воздействия.RRСхема химической модификации. Х – модифицируемый остатокаминокислоты в активном центре, R – химический реагент.Подбор химических модифицирующих агентов для селективного мечения белковВ то же время химические реагенты, действующие на группыопределенного типа, модифицируют в той или иной степени всеоднотипные группы. Поэтому в большинстве случаев одновременно спревращением групп, участвующих в функционировании белка илинуклеопротеида, затрагиваются и другие группы того же типа, что взначительной мере обесценивает получаемую информацию.Рассмотрим подходы, позволяющие обеспечить селективнуюмодификацию определенных функциональных групп в белках.Клеточные системы синтеза белков, а также ферменты, могут внедрять в структурыбелков неприродные аминокислоты, ошибочно принимая их за природные.

Вчастности, было обнаружено, что замена метионина в питательной среде бактерий нагомопропаргилглицин (Hpg) или азидогомоаланин (Aha) позволила встроить этисинтетические аминокислоты в синтезируемые клеткой белки. Такие белки содержалибиоортогональные функциональные группы — азид либо алкин, и введение в клеткубиотина и флуоресцентных красителей, снабжённых комплементарнойфункциональной группой (фосфин, циклооктин либо азид) дало возможностьселективно пометить и изучить данные белки. Кроме того, азидогомоаланин игомопропаргилглицин были использованы одновременно для параллельноймодификации двух различных типов белков.Химическая модификация функциональных групп в белках.Подходы, позволяющие обеспечить селективную модификацию определенныхфункциональных групп в белках.Методы химической модификации IgG,фрагментов антител и белков на N- или CконцахTCEP–Tris(2-carboxyethyl)phosphine;DTT–dithiothreitol.Предложите механизмы для реакций,представленных на схеме с и d.Селективная химическая модификация сульфгидрильных групп в белкеВлияние рКa функциональных групп биополимеров на ихреакционную способностьИзменение рКa боковых радикаловаминокислотных остатков вследствие ихокружения в составе белков являетсяодним из главных факторов, определяющихих реакционную способность.Например, большинство аминокислотреагируют в непротонированной форме, азначения рКa для фyнкциональных групподинакового строения, в зависимости от ихокружения в молекуле белка, могутотличаться на 2 единицы.Модификация остатка серина протеаз, R=-СН2ОНДля модификации серина в активном центре протеаз:BrCH2C(O)NH2BrCH2COOHBr-ацетамидBr-уксусная кислотаICH2COOHI-уксусная кислотаПри рН 6-7 модификации подвергался остаток Ser, хотя при таких значениях рН серинизначально проявляет слабую нуклеофильность.В растворе такая реакция не пойдет, а в активном центре нуклеофильность серинасущественно повышается при помощи гистидина, оттягивающего на себя протон в пареSer-His (см.

следующий слайд).Схема активного центра сериновых протеаз и механизм их действияСелективная химическая модификация концевой аминогруппы в рекомбинантных белках.С развитием техники генной инженерии и производства белков с использованием рекомбинантных ДНК возникло новое направление аффиннойхроматографии, связанной с использованием хелатных сорбентов.

Оно основано на введении в транскрибируемый ген специальныхпоследовательностей, обеспечивающих в процессе трансляции синтез гистидиновых последовательностей размером 6-15 аминокислот, обладающихвысоким сродством к ионам переходных металлов, которые вводятся в качестве аффинных лигандов в состав сорбентов. Целевой продукт с высокойспецифичностью извлекается таким сорбентом из клеточного экстракта, выделяется в чистом виде. Наличие олигогистидинового фрагментаобеспечивает селективность модификации по концевой аминогруппе.Объясните, за счет чего обеспечивается селективность модификации концевой аминогруппы (см.на схеме).ЭпиВакКорона. GGSGHHHHHHSG.

Нуклеокапсидный белок коронавируса, экспресированный в E.coli (носитель- мальтоза-связывающий белок изкишечной палочки). Три пептида из S-белка коронавируса химически присоединены.Подходы, позволяющие обеспечить селективную модификацию определенныхфункциональных групп в белках.Дляполученияболееопределенныххимическихданных о связи функции соструктурой наиболее важноезначение приобрели методы,получившиеназваниеаффинной модификации.Основная идея метода состоитв использовании реагентов,которыенарядусреакционноспособной группойопределеннойхимическойспецифичностисодержатостаток,обладающийспецифическим сродством копределенному функциональнозначимомуучасткумодифицируемогобиополимера.Часть, обеспечивающая специфичноенековалентное связывание реагентас биополимеромАффинный реагентРеакционноспособная группа,за счет которой происходитковалентное присоединениереагента к акцептору в биополимереСхема классической модификацииБелок-мишень содержит лиганд–связывающий центрОбразование комплекса между меченымреагентом и белком-мишеньюОбразование ковалентной связимежду реакционноспособнойгруппой реагента и белком-мишеньюИдентификация модифицированнойчасти белкаСветлые овалы обозначают аффинную частьреагента; темные кружочки – реакционноcпособную группу реагента, а звездочки –метку, например, радиоактивную.Структурно-функциональный анализнадмолекулярных комплексовМетод аффинной модификации дляисследования надмолекулярныхкомплексов матричного биосинтезаМетод основан на применении реагентов,способных осуществить высокоспецифичнуюхимическую модификацию биологическихобъектов за счет предшествующего химическойреакции образования специфичного комплекса:реагентобъект модификации161.

Метод аффинной модификации, основанный наиспользовании реакционноспособных структур ДНК,имитирующихпромежуточныеинтермедиатыпроцессоврепарации,позволяетизучатьфункционирование ансамблей белков репарации.2. Аффинная модификация в сочетании с MALDI-MS прииспользовании на уровне экстрактов клеток и ядерпозволяет открывать новые белковые факторы,участвующие в этих процессах.3. Разработанныеметодыидентификациибелковрепарации в экстрактах клеток позволяют оцениватьстатус систем репарации.ПоврежденнаяДНКОстановкаРепарацияклеточногоДНКциклаАпоптоз программируемаяклеточнаясмертьМутацииРакМеханизмы повреждений и репарации ДНКалкилирующиеагентыспонтанные реакцииэндогенные окислителиактивные формы кислородаУФ-излучениемутагеныокружающей средырентгеновскоеизлучениеошибкирепликацииO6-meGапуриновые/апиримидиновые(АР-) сайтыокисленныедезаминированные иалкилированные основанияоднонитевые разрывыпиримидиновыедимерыкрупные аддуктыдвойныеразрывынеправильноеспариваниеоснованийвставки, делециипрямая репарациярепарацияоснованийрепарациянуклеотидоврепарациядвойныхразрывов ДНКрепарациянеправильноспаренныхоснованийБелки репарации ДНК, взаимодействующие сАР-участками (АР-сайтами) в ДНКАP-сайт вблизидвухцепочечного разрываАР-сайтАР-сайтГидролизованныйнапротив брешиАР-сайтВсе идентифицированные белки ответственны за чувствительность клеток к ионизирующемуизлучению.