1631210422-972e26bf3b24afe5e58bdf1a7ac3dbe3 (Лекция 7 - Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов)

Твердофазный фосфотриэфирный метод синтезаолигонуклеотидов (амидофосфитный вариант).Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов.Антисмысловые олигонуклеотиды и их модифицированныеаналоги. Получение аналогов олигонуклеотидовОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены красным жирным шрифтом.Познакомьтесь, пожалуйста, с презентацией для следующей лекции и если что-то непонятно, задайте в вотцапе или попочте вопросы, чтобы полноценно усвоить материал.На данный момент выполнили задание:Задворных Данила ДЗ1; ДЗ2;ДЗ3; Литвинова Виктория ДЗ1; Карпова Лидия ДЗ1;ДЗ2;ДЗ3; Бахно Ирина; Горбунова ЕкатеринаДЗ1;ДЗ2; Орлова Кристина ДЗ1; ДЗ2; Толстова Полина ДЗ1; ДЗ2; Соловьев Никита ДЗ1; ДЗ2; Косенок Алексей ДЗ1; ДЗ2; ДЗ3; МаловаЕвгения ДЗ1; ДЗ2; Шалаева Наталья ДЗ1; ДЗ2.От других ребят я не получила писем ни с ответами, ни с вопросами, если что-то непонятно. Мне необходимо для обобщения ответов ипроведения дискуссии иметь информацию ото всех.

Более того, по выполнению домашнего задания я могу увидеть, как вы работаетезаочно.У меня в списке числятся: Никотина Анастасия, Григорьева Евгния, Фандо Анастасия, Илющенко Валерия, Айбульгина Диана,Ерошенко Дарья. Эти ребята выбыли, или у них уважительная причина отсутствовать на лекциях?Что необходимо знать после лекции•Методы образования фосфодиэфирной связи: химические и ферментативные методы синтеза. Фосфодиэфирный и фосфотриэфирный методы синтезаолигонуклеотидов. Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов (амидофосфитный вариант). Н-фосфонатный синтезолигорибонуклеотидов.•Схема синтеза фосфодиэфирной связи твердофазным амидофосфитным методом. Образование связи между Р- и ОН-компонентами.

Роль тетразола. Стадиякэпирование. Окисление фосфиттриэфирного фрагмента. Цикличность синтеза на полимере как основа для автоматизации. Выделение, очистка иидентификация синтетических олиго- и полинуклеотидов.•Схема синтеза фосфодиэфирной связи твердофазным H-фосфонатным методом. Две стадии синтетического цикла: удаление диметокситритильной защиты иконденсация. Использование нуклеозидных H-фосфонатов в качестве строительных блоков, а пивалоилхлорида, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорида идругих соединений – в качестве активаторов. Окисление H-фосфонатной диэфирной связи между нуклеозидами в фосфодиэфирные связи.•Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидов. Схема синтеза твердофазным H-фосфонатным методом. Реакции кэпирования и сульфурирования.• Фосфорамидные аналоги олигонуклеотидов.

Схема синтеза твердофазным H-фосфонатным методом.•Пептидные, морфолиновые, и конформационно-ограниченные аналоги олигонуклеотидов. Аналоги нуклеиновых кислот, содержащие фосфорилгуанидиновуюгруппу. Схемы синтезов. Стадии для получения мономеров аналогов олигонуклеотидов, у которых углеводный фрагмент заменен на кольцо морфолина:последовательное окисление цис-диольной группы периодатом, обработка аммиаком для замыкания в морфолиновый цикл, восстановление вторичных ОНгрупп боргидридом натрия, защита атома N-морфилинового цикла тритильной группой, введение по первичной ОН-группе хлордиметиламидофосфорильнойгруппы.

Селективное алкилирование по атомам азота в пуринах и пиримидинах и последующее ацилирование – ключевые шаги в синтезе пептидных аналогов.Сходство и различие между обычными нуклеиновыми кислотами, тиофосфатными и фосфорилгуанидиновыми аналогами нуклеиновых кислотами.Области применения олигонуклеотидов и их модифицированных аналогов.ПРИМЕРЫ АНАЛОГОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.Начинаем рассматривать синтез и применение аналогов олигонуклеотидов.В наши дни разработкой и синтезом олигонуклеотидов и их модифицированных аналоговзанимается большой исследовательский и индустриальный сектор экономики. Созданные на ихоснове противовирусные и противовоспалительные препараты проходит клинические испытания,а некоторые уже используются в медицинской практике. В том числе «на родине» антисмысловыхтехнологий ведутся разработки препаратов, эффективно блокирующих гены, отвечающие залекарственную устойчивость раковых клеток и патогенных микроорганизмов.Олигонуклеотиды – агенты избирательногодействия на первопричину болезниОлигонуклеотид3´ T5´G C A 5´C C A C G T C C 3´Универсальность использованияолигонуклеотидов обусловлена возможностьюпрямой реализации принципа:«есть мишень – есть направленный агент»Олигонуклеотиды – это относительно короткие фрагментынуклеиновых кислот, способные распознавать комплементарныеим последовательности ДНК или РНК и образовывать с нимиспецифическиекомплексы.Этаспособностьпозволяетолигонуклеотидам направленно воздействовать на работу генов иблокироватьпереносгенетическойинформации.Олигонуклеотиды и их производные находят применение вкачестве веществ с направленным воздействием на биологическиепроцессы в живых организмах.

В этих случаях необходимообеспечить их стабильность в биологических средах, где ониподвергаютсявоздействиюнуклеаз.Поэтомупередбиоорганиками встает вопрос о создании таких конструкций,которыеприсохраненииприсущейолигонуклеотидамбиологическойактивностиобладалибыповышеннойустойчивостью к нуклеазам или вообще не могли служитьсубстратами данных ферментов. Перспективным представляютсяподходы, основанные на кардинальных изменениях сахарофосфатного остова, несущего гетероциклические основания,которые являются основными носителями информации.

Остаткифосфорнойкислотыиуглеводавкомплементарныхвзаимодействиях непосредственно не участвуют. Поэтому онимогут быть использованы как районы присоединенияфункциональных групп. В настоящее время создано нескольковариантов модифицированного сахаро-фосфатного остова,которые сохраняют взаимное расположение гетероциклическихоснований и тем самым способность к специфическивзаимодействиямскомплементарныминуклеотиднымипоследовательностями в ДНК и РНК.Олигонуклеотиды и их модифицированные аналоги – биологически активные вещества,направленные непосредственно на генетические мишени – ДНК и РНК.Регулировать экспрессию генов с помощьюантисмысловых олигонуклеотидов можно наразных уровнях, начиная с процессатранскрипции – считывания генетическойинформации с ДНК на РНК, которыйпроисходит в ядре клетки и включает в себястадию созревания РНК, в результате которойобразуется пул молекул РНК с разнымифункциями(транспортнаятРНК,переносящая аминокислоты; рибосомальнаярРНК, входящая в состав рибосом, и т.д.), допроцесса трансляции – синтеза белка наматричной РНК (мРНК), который происходитвцитоплазменарибосомах.Всетерапевтическиеолигонуклеотидытрадиционно принято подразделять на геннаправленные – их мишенью являетсягеномнаяДНК,инасобственноантисмысловые – их мишенью являютсяРНК.Отдельновыделяютгруппуолигонуклеотидов,работающихпомеханизму РНК-интреференции.Аналоги олигонуклеотидов с различными модификациями рибозофосфатного скелетаНаиболее широко в настоящее время применяютсяаналоги олигонуклеотидов с различными модификациямирибозофосфатного скелета.

Именно такие модификациирегулируютспецифичностьформированиякомплементарных комплексов с целевой ДНК, повышаютустойчивость олигонуклеотидов к гидролизу нуклеазами,не увеличивая их токсичность. Среди таких аналоговможно выделить: а – тио-аналоги, отличающиеся отприродных нуклеиновых кислот лишь заменой одного изатомов кислорода в каждой фосфатной группе на атомсеры; б – аналоги, содержащие 2’-модифицированныеостатки рибозы, в которых гидроксильная группа чащевсего метилирована либо заменена на атом фтора; в –LNA-аналоги с сахарофосфатным остовом, структуракоторых стабилизирована метиленовым или этиленовыммостиком, разработаны в компании «Эксикон» (Дания)бывшим сотрудником ИХБФМ СО РАН А. Кошкиным; г –пептидо-нуклеиновые кислоты, в которых сахарофосфатный остов заменен полиамидным; д – морфолино, вкоторых азотистые основания связаны со скелетом,состоящим из остатков морфолина, чередующихсяс диметиламидофосфатной группойНа лекции №6 мы рассмотрели вопросы, касающиеся получения тиофосфатных аналогов олигонуклеотидов.Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидовК настоящему времени допущено на фармацевтический рынок США лекарство VitraveneTM,которое представляет собой 21-звенный фосфоротиоат [Yan.

J. Chem. Perkin Trans.2002]Тиофосфатные олигонуклеотиды — это модифицированныеолигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода вфосфатном остатке замещен на атом серы. Широкоиспользуются только те тиофосфаты, в которых сера неявляется связующим звеном между нуклеозидным остаткоми атомом фосфора. В этом случае замена кислорода на серуприводит к образованию нового центра хиральности наатоме P(V), поэтому в простейшем случае динуклеотидаобразуются SP- и RP-диастереомеры. В n-мерномолигонуклеотиде, в котором все (n-1) межнуклеотидныхсвязей являются тиофосфатными, число диастереомеровсоставляет 2(n-1).• Будучи неприродными аналогами нуклеиновыхкислот, олигонуклеотидные тиофосфатызначительно более устойчивы к гидролизунуклеазами.

Это свойство определяетиспользование тиофосфатов в качествеантисмысловых олигонуклеотидов вприложениях in vivo, где неизбежно воздействиенуклеаз. Подобным образом, чтобы увеличитьстабильность в малых интерферирующих РНК,часто вводят, по крайней мере, однутиофосфатную связь в 3'-положение смысловойи антисмысловой цепи. В оптически чистыхолигонуклеотидных тиофосфатахдиастереомеры, в которых все фосфорныецентры имеют SP-конфигурацию, болееустойчивы к ферментативному гидролизу, чемих RP-аналоги. Однако, синтез оптическичистых тиофосфатов сложен. В лабораторнойпрактике обычно пользуются смесямидиастереомеров.Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов и тиофосфатных аналогов олигонуклеотидов.Дополните схему недостающимися реагентами (задание для тех, кто еще не сдал задание №3).Используют нуклеозидные H-фосфонаты в качестве строительных блоков.В качестве активаторов – пивалоилхлорид (CH3)3CC(O)Cl илитриизопропилбензолсульфонилхлорида (TIPS-Cl).2,4,6-Две стадии синтетического цикла:1)Удаление диметокситритильной защиты.2)Конденсация.