1631210421-a96b90a33588a5fa05cec0217194a441 (Лекция 6 - Химико-ферментативные методы синтеза нуклеотидов)

Химико-ферментативные методы синтеза олиго- и полинуклеотидовФосфодиэфирный метод синтеза олигонуклеотидов.Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов(амидофосфитный вариант).Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов.Антисмысловые олигонуклеотиды и их аналоги. Получениетиофосфатных аналогов олигонуклеотидовОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены красным жирным шрифтом.Познакомьтесь, пожалуйста, с презентацией для следующей лекции и напишите в вотцапе или на почту, комунеобходимо встретиться очно, чтобы полноценно усвоить материал.

Если я получу письма о необходимости провестизанятия очно, то, несмотря на тревожную обстановку по заболеваемости, мы это занятие проведем, выполнив все мерыбезопасности.Жду вашего решения.На данный момент выполнили задание 1:Задворных Данила; Литвинова Виктория; Карпова Лидия; Бахно Ирина; Горбунова Екатерина; Орлова Кристина; Толстова Полина.От других ребят я не получила писем ни с ответами, ни с вопросами, если что-то непонятно. Мне необходимо для обобщения ответов ипроведения дискуссии иметь информацию ото всех. Более того, по выполнению домашнего задания я могу увидеть, как вы работаетезаочно.Что необходимо знать после лекции•Методы образования фосфодиэфирной связи: химические и ферментативные методы синтеза.

Фосфодиэфирный и фосфотриэфирный методы синтезаолигонуклеотидов. Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов (амидофосфитный вариант). Н-фосфонатный синтезолигорибонуклеотидов.•Защита функциональных групп. Характер защитных групп при химическом синтезе олигонуклеотидов. Временные и постоянные защитные группы. Основныетребования к защитным группам. Блокирование и деблокирование аминогрупп гетероциклических оснований: ацетильная, бензоильная, изобутирильнаязащиты. Основные способы введения и удаления защитных групп, механизмы соответствующих процессов. Блокирование и деблокирование гидроксильныхгрупп остатков пентозы: диметокситритильная защита (5’-ОН-группы); ацильная (3’-ОН-группы); трет-бутилдиметилсилильная итриизопропилсилилоксиметильная защиты (2’-ОН-группы).

Основные способы введения и удаления защитных групп, механизмы соответствующих процессов.•Приготовление нуклеозидного (ОН-компонента) и нуклеотидного (Р-компонента) компонентов. Введение защитных групп в нуклеозиды. Получениенуклеотидного компонента через фосфорилирование нуклеозида соединениями трехвалентного фосфора. Ненуклеозидные амидофосфиты для введения волигонуклеотиды различных групп: 5'-фосфата, аминогруппы, меркаптогруппы, альдегидной и карбоксильной групп, алкиновых фрагментов, флуоресцентныхкрасителей и тушителей, гидрофильных и гидрофобных модификаций, биотина.

Способы присоединения первого нуклеозидного остатка к полимерномуносителю и снятия синтезированного олигонуклеотида с полимера. Универсальные, нуклеозидные и специальные носители.•Схема синтеза фосфодиэфирной связи твердофазным амидофосфитным методом. Образование связи между Р- и ОН-компонентами. Роль тетразола. Стадиякэпирование. Окисление фосфиттриэфирного фрагмента. Цикличность синтеза на полимере как основа для автоматизации. Выделение, очистка иидентификация синтетических олигонуклеотидов.•Схема синтеза фосфодиэфирной связи твердофазным H-фосфонатным методом. Две стадии синтетического цикла: удаление диметокситритильной защиты иконденсация. Использование нуклеозидных H-фосфонатов в качестве строительных блоков, а пивалоилхлорида – в качестве активаторов. Окисление Hфосфонатной диэфирной связи между нуклеозидами в фосфодиэфирные связи.•Антисмысловые нуклеиновые кислоты и их аналоги.•Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидов.

Схема синтеза твердофазным H-фосфонатным методом. Реакции кэпирования и сульфурирования.ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ СИНТЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАКТИВАЦИЯ ФОСФАТНОЙ ГРУППЫГлавным процессом при синтезе олиго- и полинуклеотидов измономеров является образование новых связей междунуклеотидными звеньями (межнуклеотидных связей). Дляполучения олиго- или полинуклеотида, состоящего из nмономерных звеньев, должно быть образовано n - 1межнуклеотидных связей.

При образовании каждой такойсвязи один из компонентов является донором ОН-группы (Окомпонент), а другой – донором атома Р для образуемой связи(Р-компонент). Образование связи между ОН-группой Окомпонента и остатком фосфорной килты Р-компонента, какуже указывалось в предыдущей лекции, термодинамическиневыгодно. Поэтому при образовании каждой новоймежнуклеотидной связи используется реакционноспособноепроизводное Р-компонента.Способность полинуклеотидов к репликации открыловозможность «размножать» полученные полимеры, т.е.получать необходимое количество продукта из оченьнезначительного изначального количества.

Такое«размножение» является ферментативным процессом,поскольку основано на использовании ДНК-полимераз, вслучае синтеза ДНК, или РНК-полимераз для получениямолекул РНК. В случае ферментативного синтеза в качестве Ркомпонента используются нуклеозид-5’-трифосфаты с богатойэнергией ангидридной связью.Одной из задач, стоящей на пути химического синтеза олиго- иполинуклеотидов, является активация Р-компонента. Прирешении данной задачи биоорганики опирались на подход,созданный самой Природой для осуществления процессалигирования при «сшивки» двух фрагментов Оказаки.Фосфодиэфирный методПионером химического синтеза олигонуклеотидов был Гобинд Корана (лауреат Нобелевской премии 1968 г.).В 1950-х гг. Корана с сотрудниками разработали фосфодиэфирный метод, в котором 3'-O-ацетилнуклеозид-5'-O-фосфат активировался N,N'дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или п-толуолсульфонилхлоридом (TsCl), а затем вводился в реакцию с 5'-O-защищённым нуклеозидом собразованием динуклеозидмонофосфата.

В 1970 г. они осуществили первый синтез гена. Подходы, использовавшиеся в этих работах, былиоснованы на взаимодействии фосфатной группы нуклеотида или олигонуклеотида в качестве Р-компонента с ОН-группой О-компонента вприсутствии конденсирующего агента, который служил для активации фосфатной группы. В качестве последнего наилучшим образомзарекомендовал себя триизопропилбензолсульфохлорид. Данный метод приводил непосредственно к образованию межнуклеотидных связей в видефосфодиэфиров.

Этот подход получил название фосфодиэфирный метод синтеза олигонуклеотидов.С использованием фосфодиэфирного метода были синтезированы наборы три- и тетрадезоксирибонуклеотидов, которые затем были превращены вболее длинные олигонуклеотиды, позволившие расшифровать генетический код. Главным ограничением метода является образованиепирофосфатных олигомеров и олигонуклеотидов, разветвлённых у межнуклеозидной фосфатной группы. Подумать и предложить механизм ихобразования.Отсутствие удобной стратегии защиты потребовала отказа от данного метода.Фосфотриэфирный метод синтезаВ 1960-х гг.

под руководством Р. Летсингера (R. Letsinger) и К. Риза (C. Reese) был разработан фосфотриэфирный метод.Определяющее отличие от фосфодиэфирного подхода состоит в предварительной защите фосфата Р-компонента и продуктаконденсации цианэтильной группой, в результате чего при конденсации их с ОН-группой О-компонента образуютсяфосфотриэфиры. В связи с этим такой подход получил название фосфотриэфирного метода синтеза олигонуклеотидов.Предварительная защита фосфата исключила возможность образования олигонуклеотидов с разветвлением у фосфатных групп.Бо́льшая селективность метода позволила использовать более реакционноспособные конденсирующие реагенты икатализаторы, которые значительно уменьшили продолжительность синтеза.

Метод, изначально разработанный для синтеза врастворе, был также применен и в твердофазном синтезе, первоначально на полистироле с низкой степенью сшивки, чтоинициировало широкий научный поиск в твердофазном синтезе олигонуклеотидов и в конечном итоге привело к автоматизациисинтеза.TPSCl – триизопропилбензолсульфохлорид.Фосфитный триэфирный метод(амидофосфитный подход)Реакционноспособные синтоны (производные мономеров,непосредственно используемые для образования новой связи),которые используются в фосфитном методе синтеза получаютпутемвзаимодействия2-циано-N,Nдиизопропилхлорфосфорамидита с защищенными нуклеозидами.2-циано-N,N-диизопропилхлорфосфорамидит получают исходя изPCl3.

и N,N-диизопропиламина.Для предотвращения реакции с гетероциклическими основаниямиих функциональные группы блокируют. Это достигаетсявведением защитных групп, которые должны присутствовать вдальнейшем на протяжении всего синтеза олигонуклеотида иудаляться после завершения синтеза всей олигонуклеотиднойцепи. Такие защитные группы классифицируются какпостоянные защитные группы.Для защиты A, dA, C и dC используется бензоильная защита (Bz),тогда как G и dG защищаются изобутирильной группой.Позже для защиты C и dC была предложена ацетильная (Ac)группа, которая может быть удалена и аммиаком, и, существеннобыстрее, смесью аммиака с метиламином.Фосфитная группа защищается 2-цианэтильной группой. Раньшеиспользовалась О-метильная защита.ВРЕМЕННЫЕ ЗАЩИТНЫЕ ГРУППЫПри соединении Р- и О-компонентов в синтезеолигонуклеотидов с определенной последовательностью Ркомпонент не должен содержать ОН-группы, способной кобразованию связи с атомом Р.

В противном случае возможнавнутримолекулярная реакция с образованием Р-О-связи.Поэтому в Р-компоненте ОН-группа должна быть блокирована.Следовательно, она будет закрыта и в образовавшемсяпродукте, и для наращивания полинуклеотидной цепи ееследует деблокировать. Это достигается предварительнымвведением в Р-компонент специальной защитной группы. Онадолжна присутствовать на стадии образованиямежнуклеотидной связи и удаляться перед образованиемследующей межнуклеотидной связи. Важнейшим свойствомзащитной группы является возможность ее удаления вусловиях, не приводящих к разрушению ранее образованныхмежнуклеотидных связей.

Такие защитные группы, вводимыеперед каждой стадией образования новой связи и удаляемыеперед следующей, рассматриваются как временные защитныегруппы.В современных методах синтеза временной защиты требуется восновном 5’-концевая ОН-группа наращиваемой цепи, для чегов основном используют диметокситритильную группу(DMT/ДМТ/(MeO)2Tr – принятые обозначения), котораявводится в Р-компонент взаимодействием сдиметокситритилхлоридом.

В силу большого объемазаместителя реакция проодит достаточно селективно по 5’-ОНгруппе нуклеотида. Диметокситритильная группа легкоудаляется мягкой обработкой кислотой.ЗАЩИТНЫЕ ГРУППЫ ПРИ СИНТЕЗЕ ОЛИОРИБОНУКЛЕОТИДОВОбразование новых фосфодиэфирных связей междурибонуклеотидами и многие защитные группы,используемые при синтезе рибонуклеотидов, чаще всегоне отличаются от используемых при синтезедезоксирибонуклеотидов.

Основным отличием присинтезе рибоолигонуклеотидов является наличие 2’-ОНгруппы, и задача состоит во введении постояннойзащиты по этой группе. В синтезе РНК, 2'гидроксильнуюгруппузащищаюттретбутилдиметилсилильной(TBDMSi)илитриизопропилсилилоксиметильной (TOM) группой.Реакцияпротекаетнеселективно.Необходимопоследующее разделение для выделения целевогопродукта.