1631210415-7aa5d1a33c60d25f6e8155093050c0b9 (Лекция 22 - Модификация гетероциклических оснований нуклеиновых кислот)

Модификация гетероциклическихоснований нуклеиновых кислотРеакции по С(6)-С(5) связи и С4 впиримидинах1Что нужно знать после лекции•••••Реакции по связи С5-С6. Реакция присоединения-отщепления по двойной связи С5-С6 пиримидинов:взаимодействие с бисульфитом натрия. Бисульфитное секвенирование ДНК. Реакции пиримидиновыхоснований с бисульфитом натрия как способ введения мутационных замен.

Реакциипереаминирования как способ введения различных группировок по С4-положению цитозина.Введение различных группировок по С4-положению уридина.Реакции расщепления гетероциклических оснований нуклеиновых кислот (реакция пиримидинов сгидразином). Метод Максама Гилберта.Использовании 5-меркуриопроизводных нуклеиновых кислот для получения специфически меченныхпиримидиновых оснований нуклеиновых кислот. Получение фотоактивируемых зондов.Двухступенчатая гибридизация in situ.

Синтез производных нуклеиновых кислот, снабженныхрепортерными группами. Введения различных функциональных групп по разным положениям науровне олигонуклеотида.Реакции присоединения и замещения по атомам углерода. Галоидирование гетероциклическихоснований в водной среде. Механизм реакции на примере взаимодействия остатков пиримидинов сбромной водой.

Галогенирование пиримидиновых оснований в составе нуклеозидов в присутствииаммоний-церий нитрата. Галоидирование в неводной среде как пример реакций электрофильногозамещения по положению С5. Спектральные и кислотно-основные характеристики нуклеозидныхпроизводных урацила и его галоидзамещенных. Бромдезоксиуридина как мутаген. Методинкорпорации 5-бромдезоксиуридина.

Использование галогенпроизводных для введения репортерныхгрупп в гетероциклические основания. Получение терминирующих нуклеозид-5’-трифосфатов длясеквенирования по Сэнгеру.Реакции пиримидиновых оснований с нуклеофильными группами белков. Отличительные особенностивзаимодействия галогенпроизводных с нуклеофильными группами белков. Химиотерапия рака.2Реакция присоединения-отщепления по двойной связи С5-С6пиримидинов: взаимодействие с бисульфитом натрияБисульфит-ион способен обратимоприсоединяться к С5-С6-двойнымсвязям цитозина, урацила итимина в мягких условиях, образуясоответствующий аддукт,неустойчивый в случае тимина;практическое значение имеюттолько реакции с урацилом ицитозином.

Продуктыприсоединения к урацилу ицитозину довольно стабильны внейтральной кислой средах, ноотщепляют бисульфит-ион вщелочной среде.3РЕАКЦИИ ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ С БИСУЛЬФИТОМНАТРИЯ КАК СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ МУТАЦИОННЫХ ЗАМЕНМодификация нуклеиновых кислот бисульфитом частоиспользуется как способ введения мутационных замен.С этой целью участок ДНК, выбранный для введениямутаций, превращают в одноцепочечный и затемобрабатывают бисульфитом в условиядезаминирования. Таким образом, например, пары G-Cмогут быть заменены на пары А-Т (такие заменыназываются транзициями).Важным свойством 5,6-дигидропроизводных цитозинаявляетсяповышеннаяреакционноспособностьаминогруппы, которая легко замещается под действиемразличных нуклеофильных агентов. Замещениеаминогруппы на гидроксигруппу приводит кпроизводному урацила, которое легко превращается вурацил при слабоосновных значениях рН.

Такимобразом,этареакциядаетвозможностьспецифического преобразования цитозиновых колец вурацильные.4Анализ пространственногостроения полинуклеотидаРеакциябисульфитасодноцепочечныминуклеиновымикислотами протекает значительномедленнее, чем с мономерами. Ипрактическинеидетсдвухцепочечнымимолекулами.Специфичностьквторичнойструктуре используется для анализапространственногостроенияполинуклеотида. Так, обработкатРНК бисульфитом приводит кмодификации только цитозиновыхоснований, которые находятся впетлях.5Бисульфитное секвенирование ДНК6Способ введения различных группировок по С4-положениюпиримидинов (реакция переаминирования)Важнымсвойством5,6-дигидропроизводныхцитозинаявляетсяповышеннаяреакционноспособность аминогруппы, котораялегко замещается под действием различныхнуклеофильныхагентов.Предварительнаямодификацияцитозиновых гетероцикловбисульфитом обеспечивает возможность введенияпо С-4 различных группировок, напримераминолинкеров, содержащих остаток биотина илифлуоресцеина.Однако надо помнить, что выход производныхцитозина уменьшается с увеличением рКааминомостика.

(J. Molander et al. BioconjugateChem. 1994).7Способ введения различных группировок по С4положению пиримидинов (реакции по С-4положению уридина)OOSPriHNHNOHOiPrOEt3SiClNOEt3SiOONiPrTPS-ClOимидазолOOOEt3SiODMAP, Et3NNNOOHOHOSiEt3 OSiEt3OSiEt3 OSiEt3CH3COOHTHFH2OR:NHRClNH2ONNOHSSHOONHOOONH 2NOOHOHOHOH8Метод Максама-Гилберта (реакция пиримидинов с гидразином)В щелочных условиях реакции с гидразином приводят к расщеплению гетероциклических колецпиримидинов, практически не затрагивая пуриновых оснований.Для определения положения тимидина используется деградация по остаткам пиримидинов, для чего ДНКпоследовательно обрабатывается гидразином, а затем пиперидином (см.

лекцию 21).Расщепление по цитозину осуществляется при высокой концентрации NaCl с последующей обработкойпродуктов модификации пипердином.Какие из таутомеров нуклеозидов будут наиболее реакционноспособными при реакции с гидразином (вусловиях проведения секвенирования по методу Максама-Гилберта в отсутствие и в присутствие NaCl)? 9МЕРКУРИРОВАНИЕШироко распространенная в органической химии реакция непредельныхсоединений с ацетатом ртути в случае нуклеиновых кислот проходит в мягкихусловиях (вода, рН 6.0-7.0, 40-50 0С). Результатом реакции является образованиепроизводных 5-ацетоксимеркуриоурацила и 5-ацетоксимеркуриоцитозина.5-Меркуриопроизводные, вследствие легкого обмена атома ртути на атомыгалогена или трития, используются для получения специфически меченныхпиримидиновых оснований нуклеиновых кислот.10СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ NTP С ФОТОАКТИВИРУЕМЫМИ И РЕПОРТЕРНЫМИ ГРУППАМИПоиски эффективных нерадиоактивных маркеров, пригодных длямечения зондов, привели к созданию как минимум двухальтернативных меток: биотин-dNTP (bio-dNTP, фирмы Sigma иGibco-BRL) и дигоксигенин-dUTP (dig-dUTP, фирма BoehringerMannheim).Использование в качестве метки дигоксигенина, обеспечиваетбольшую специфичность и воспроизводимость, а чувствительностьметода близка к таковой для случая радиоактивно меченных зондов.Дигоксигенин присутствует только в растении дигиталис(наперстянка), что уменьшает неспецифичное окрашивание,11обусловленное взаимодействием с эндогенными соединениями.Введение фотоактивируемых групп в ДНК-зонд•OФотоактивируемый аналог dUTPHNOOOO P O P O P OOOO-OOOCH2=CH-CH2NH CFN3NOH H** **ЗондДНКГибридизацияdNTP+pppdUR* * **RRЭлонгацияh* * **ДетекцияФотоприсоединение12Двухступенчатая гибридизация in situ(д.ф.-мат.н.

А.И. Полетаев)13Возможность введения различных функциональных групп поразным положениям на уровне олигонуклеотидаИзбыточный положительный заряд на атоме С; цитозина способствует замещению на различные нуклеофилыв реакции переаминирования. Таким образом, можно ввести в положение С; цитозина алифатическуюаминогруппу, которая может быть проацилирована производными, несущими различные функциональныегруппы – фотоактивируемые, флуоресцирующие и др.

Эти реакции особенно эффективно протекают, если поатому С: введен остаток сульфита, который по окончанию реакции может быть удален в щелочной среде.Существенно, что при переаминировании один атом Н при азоте N4 сохраняется, и тем самым сохраняетсяспособность к Уотсон-Криковскому взаимодействию с комплементарным остатком G. Поэтому такиемодифицированные остатки цитозина могут служить компонентами двунитиевой структуры нуклеиновойкислоты, а соответствующие нуклеотид-трифосфаты – субстратами при репликации и транскрипции.14ПРЕДЛОЖИТЕ СХЕМУ ВВЕДЕНИЯ АМИНОЛИНКЕРА ПО ПОЛОЖЕНИЮ С5 ОСТАТКА УРИДИНА«ПОДВОДНЫЕ КАМНИ»При работе с аллиламином и егопроизводными могут протекать«незапланированные»реакциипо С-4 положению гетероцикла.15Галогенирование пиримидиновых оснований.БромированиеОдним из распространенных методовмодификации оснований в нуклеиновыхкислотах является галогенирование.Реакция протекает по разныммеханизмам в водных и безводныхсредах.Механизмы:При бромировании (или хлорировании)нуклеиновых кислот в водных средахпроисходит присоединение галогена поС(5)-С(6) двойной связи колецпиримидина и разрушение гуанина.А если в органических растворителях?1.

Катион галогена реагирует с системой, образуя неустойчивый комплекс.2. -комплекс разрушается и образуется-комплекс.3. Нуклеофил (анион) атакуетобразовавшийся карбокатион.16Галогенирование гетероциклических оснований•••••••Бромирование - 0 0C, несколько минутХлорирование (Сl2) – комнатная температура, несколько часовИодирование (I2, HNO3) – несколько часовBr2  Cl2  ICl  I2При использовании радиоактивного 125I удается получить меченые полинуклеотиды свысокой удельной активностью.N-галоидимиды являются эффективными галоидирующими агентами,позволяющими в чрезвычайно мягких условиях производить замену водорода при С5 пиримидинового цикла.