11094 (Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації), страница 3

Початкова фаза переходу з Whole-cell в Outsіde-out. Перехід в outsіde-out. Заключна фаза.

Мембранна трубка стала зовсім тонкою й майже невидимою ("протуберанець" у поверхні клітини - це невелика частина цитоплазми, що залишилася в мембранній трубці). У наступну мить трубка порветься, а мембрана зімкнеться на піпетці в "вивернутому" виді - ми опинемось в конфігурації "outsіde-out"

Perforated patch

Perforated patch ("перфорований patch") - це специфічний варіант patch-clamp в whole-cell mode. У цьому випадку, у піпетковому розчині утримується невелика кількість спеціального антибіотика. наприклад, граміцидина. Антибіотики цього класу формують іонні канали в клітинній мембрані на ділянці, приєднаній до мікропіпетки.

Такий підхід дозволяє уникнути заміщення внутрішнього середовища клітини розчином з піпетки-електрода, тобто клітина залишається живою з мінімальними, наскільки це можливо, ушкодженнями. Таким чином, відповіді клітки на подразники є максимально наближеними до природного. У той же час, даному методу властиве ряд недоліків. По-перше, у порівнянні із класичним whole-cell mode, електричний опір доступу (яке складається з опору піпетки й опору в місці з'єднання піпетки з мембраною) є значно більш високим. Це знижує якість фіксації потенціалу, підвищує рівень шуму при записі, і збільшує значення всіх помилок, пов'язаних зі змінами опору повного ланцюга (від електрода в зовнішньому розчині до електрода в піпетці). По-друге, для того, щоб антибіотик подіяв, потрібно досить багато часу (до 30 хвилин), що істотно зменшує корисний період експерименту. І, по-третє, антибіотик ушкоджує мембрану також й у місці з'єднання з кінчиком піпетки, що приводить до прискореного руйнування гігаомного контакту й додатково зменшує ефективний експериментальний час. Таким чином, даний варіант методу може бути з успіхом використаний тільки в експериментах, які не вимагають тривалого часу для виявлення досліджуваних явищ.

Nucleated patch

Цікавий різновид patch-clamp - nucleated patch. (Фіксація потенціалу із клітинним ядром).

Метод полягає в наступному. Піпетка підводить до клітини, а потім ривком пробиває мембрану. Після цього кінчик піпетки підводить до клітинного ядра, на піпетку подається невеликий негативний тиск. У результаті піпетка присмоктує до ядра. Потім піпетка з ядром на кінці плавно приділяється назад і виймається із клітини. Піпетку необхідно вивести із клітини таким чином, щоб ділянка мембрани в місці виходу "наділася" на ядро, що присмокталося, і відірвалася, обернувшись довкола нього. У результаті виходить специфічний варіант outsіde-out patch, при якому набагато більший, ніж у звичайному варіанті методу, ділянка мембрани приєднана до кінця піпетки, будучи обгорнутою навколо клітинного ядра.

Фіксація потенціалу й фіксація струму

Коли вивчаються зміни провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, зручно фіксувати потенціал і вимірювати струм каналу - як ми дотепер й описували. Цей, найчастіший варіант patch-clamp, називається voltage clamp (фіксація потенціалу). Однак, іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, пов'язані зі зміною мембранного потенціалу - наприклад, проведення нервового імпульсу. У таких випадках можна надійти протилежним образом: зафіксувати на постійному рівні струм, і вивчати зміни різниці потенціалів при цьому. Такий варіант називається current clamp (фіксація струму).

Приклади записів, одержуваних методом patch-clamp

Запис струму одиночного каналу (гліцинового рецептора)

Запис одиночного каналу рецептора гліцину. Чітко видно два стани: закрите (йому відповідає нульовий струм) і відкрите (йому відповідає струм приблизно в 7 пикоампер). Канал час від часу спонтанно переходить із одного стану в інше, проміжних станів немає. Запис дозволяє одержати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу й струму) і ймовірність знаходження у відкритому стані (обумовлене як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий). До слова, найчастіше активність каналу фізіологічно регулюється шляхом зміни цієї ймовірності.

Запис амилорид-чуттєвого струму в головній клітині збірної трубки бруньки в конфігурації whole-cell.

Запис у конфігурації whole-cell. Клітина епітелію збірної трубки. Трансмембранний потенціал -60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в оточуючий розчин уводиться амилорид - інгібітор епітеліального натрієвого каналу (час введення показаний темними прямокутниками). До речі, чутливість до інгібіторів - це ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амилорида щораз призводить до падіння струму до нуля, із чого видно, що практично вся провідність при -60 мВ у даній клітині - це провідність епітеліального натрієвого каналу. На противагу попереднього запису, зміни струму виглядають безперервними - це пов'язане з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, є приблизно 2000 рівнів струму - від "усі відкриті" до "усі закриті".

Висновки

• Потенціал дії в більшості клітин виникає за рахунок короткочасного зростання натрієвої провідності, що прагне привести мембранний потенціал до рівня натрієвого рівноважного потенціалу й за яким треба збільшення калієвої провідності, що повертає мембрану в стан спокою.

• Зростання провідностей виникає завдяки потенціалзалежності натрієвих і калієвих каналів: імовірність їхнього відкриття зростає при деполяризації.

• Експерименти на аксоні кальмара з фіксацією потенціалу надали детальну інформацію про потенціалзалежності й тимчасовий хід змін провідностей. При деполяризації мембрани натрієва провідність спочатку швидко активується, а потім інактивується. Калієва провідність активується із затримкою й залишається на високому рівні доти, поки не скінчиться деполяризація.

• Часовий хід і потенціалзалежність змін натрієвих і калієвих провідностей у точності визначають амплітуду й часовий хід потенціалу дії, а також такі характеристики мембрани, як поріг активації й рефрактерний період.

• Теоретично активація натрієвої й калієвої провідностей при деполяризації повинна бути зв'язана зі зсувом заряду усередині клітини. Ці зсуви, названі воротними струмами, удалося виміряти експериментально.

• Експерименти з використанням методу пэтч-кламп доповнили відомості, отримані в більше ранніх досвідах з фіксацією потенціалу, новими деталями про процес збудження. Так, наприклад, натрієві канали відкриваються на досить короткий час, і ймовірність їхнього відкриття в ході деполяризації спочатку зростає, а потім знижується, відповідно до активації й інактивацією натрієвої провідності в цілій клітині. Різні кінетичні моделі були запропоновані з метою опису процесів активації й інактивації каналів.

• Кальцій відіграє важливу роль у збудженні. У деяких клітинах саме вхід кальцію, а не натрію, відповідає за фазу росту потенціалу дії. Крім того, позаклітинний рівень кальцію визначає збудливість мембрани. Зниження позаклітинної концентрації кальцію призводить до збільшення збудливості.

Література

1. Биофизика: Учеб. для биол. спец. унив. Под ред. Б.Н. Торусова и О.Р. Кольс. — М.:Высш.шк., 1968. — 467 стр.

2. Валькенштейн М.В. Биофизика: Учеб. пособие для биолог. и физиол. факультетов университетов. — М.: Наука, 1981. — 575 стр.

3. П.Г. Костюк, В.Л. Зима, І.С. Магура, М.С. Мірошниченко, М.Ф. Шуба Біофізика / За редакцією П.Г. Костюка. — Київ: «Обереги», 2001. — 544 стр.

4. П.Г. Костюк. Микроэлектродная техника. — К.: Изд-во АН УССР, 1960. — 244 стр.

5. Регистрация одиночных каналов / Под ред. Б.Сакмана, Э.Неера. — М.: «Мир», 1987. — 275 стр.

6. Рубин А.Б. Биофизика: Учеб. пособие для биолог. и физиол. факультетов университетов: В 2-х книгах. Кн.1. Теоретическая биофизика. — М.: Высшая школа, 1987. — 319 стр.

7. Рубин А.Б. Биофизика: Учеб. пособие для биолог. и физиол. факультетов университетов: В 2-х книгах. Кн.2. Биофизика клеточных процессов. — М.: Высшая школа, 1987. — 303 стр.

8. B. Sakmann, E. Neher Single-channel recording. — 1995.

9. Numberger M., Draguhn A. Patch-Clamp Technik. — 1996.

10. Jan C. Behrends & Niels Fertig: Planar Patch Clamping. In: Neuromethods. Bd. 38, S. 411—433.