11094 (646875), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Безперервне поширення нервового імпульсу
У стані спокою вся внутрішня поверхня мембрани нервового волокна несе негативний заряд, а зовнішня сторона мембрани - позитивний. Електричний струм між внутрішньою й зовнішньою стороною мембрани не протікає, тому що ліпідна мембрана має високий електричний опір. Під час розвитку ПД, тобто при відкритті натрієвих каналів, у збудженій ділянці мембрани відбувається реверсія заряду. На межі збудженої й не збудженої ділянки починає протікати електричний струм (рух іонів Na+).
Усередині нервового волокна виникає струм від позитивного полюса до негативного полюса, тобто струм спрямований від збудженої ділянки до не збудженої. Електричний струм подразнює найближчу ділянку мембрани, деполяризує його й приводить його в стан збудження, у той час як раніше збуджені ділянки повертаються в стан спокою через стадію рефрактерності. У зв'язку з наявністю рефрактерності, зворотний хід хвилі виявляється неможливим. Таким чином, хвиля збудження електротонічно (пасивно) охоплює все нові ділянки мембрани нервового волокна. При безперервному проведенні поверхня має електрогенні властивості по всієї довжині. Тому малі кругові струми виникають на відстані в кілька мікрометрів. Збудження має вигляд хвилі, що постійно рухається. Розмір ділянки мембрани, що перебуває під впливом ПД, залежить від його тривалості й швидкості проведення. Наприклад, якщо тривалість ПД дорівнює 2 мс, а швидкість його проведення 10 м/с, то потенціал пошириться на ділянці мембрани 2 см.
Сальтаторне поширення нервового імпульсу
У мієлінізованому нервовому волокні ділянки мембрани, покриті мієліновою оболонкою, є незбудливими; збудження може виникати тільки в ділянках мембрани, розташованих в області перехоплень Ренвьє, де перебуває максимальна кількість керованих потенціалчуттєвих натрієвих каналів - 12000 на 1мкм. Час проведення порушення по мієліновому волокну назад пропорційно довжині між перехопленнями.
Поширення потенціалу по немієлізованому й мієлінізованому волокнах.
При розвитку ПД в одному з перехоплень Ренвьє відбувається реверсія заряду мембрани. Між електронегативними й електропозитивними ділянками мембрани виникає електричний струм, що подразнює сусідні ділянки мембрани. Однак стан порушення може перейти тільки на ділянку мембрани в області наступного перехоплення Ренвьєе. Таким чином, порушення поширюється по мембрані стрибкоподібно (сальтаторно) від одного перехоплення Ренвьє до іншого. "Перестрибування" ПД через ділянку між перехопленнями можливо тому, що амплітуда ПД в 5-6 разів перевищує граничну величину, необхідну для збудження середнього перехоплення. ПД може "перестрибувати" навіть через два міжперехватних проміжки. Сальтаторне проведення порушення є високошвидкісним, высокоекономічним.
Швидкість поширення ПД у фазних м’язових волокнах набагато менша (1-5 м/с), ніж у нервових волокнах такого ж діаметру. Це пов’язане в першу чергу з більшою вхідною ємністю мембрани, зумовленою тубуляторною системою м’язового волокна.
Швидкість проведення збудження в гладеньких м’язах невелика та складає декілька см/с.
Фіксація потенціалу
Кількісний опис механізмів, що беруть участь у генерації потенціалу дії, стало можливим завдяки методу виміру мембранних струмів в умові фіксації потенціалу. Цей метод дозволяє визначити, який внесок вносять іони того або іншого типу в мембранний струм, а також обчислити величину й часовий хід змін відповідних іонних провідність.
Винахід методу фіксації потенціалу
Той факт, що фіксація трансмембранного потенціалу дозволить вимірювати мембранну провідність по змінах струму при постійній напрузі, був уперше усвідомлений ще в 30-х рр. XX століття, і тоді ж англійські дослідники Алан Ходжкін й Ендрю Хакслі (Alan Hodgkіn and Andrew Huxley) почали експерименти із двухелектродною фіксацією потенціалу (2-electrode voltage clamp).
Суть методу полягає в наступному. У клітину вводяться два електроди, ще один - електрод порівняння - залишається поза клітиною. Перший внутрішньоклітинний електрод служить для виміру трансмембранної різниці потенціалів (тобто різниці потенціалів між ним й електродом порівняння), другий може подавати струм. Спеціальний пристрій - генератор сигналу - задає командний потенціал, якому повинен бути рівен трансмембранний потенціал. Обмірюваний трансмембранний потенціал подається на вхід пристрою порівняння, що віднімає обмірюваний потенціал з командного й, залежно від величини різниці, подає струм на струмовий електрод так, щоб компенсувати цю різницю. Монітор струму, у свою чергу, постійно вимірює величину струму, що для цього необхідна. В 1930-х й 40-х роках, коли працювали Ходжкін і Хакслі, не існувало мікроелектродів, тому як внутрішньоклітинні електроди використалися тонкі дроти. Це визначило вибір об'єкта - гігантський аксон кальмара діаметром 1 мм, усередину якого й вводилися ці дроти. На цьому об'єкті методом двохелектродної фіксації потенціалу дослідники виконали експерименти, у яких була встановлена іонна природа потенціалу дії й уперше постульоване існування іонних каналів (Нобелівська премія 1963 р., поділена із Дж. Екклзом, що получили її за дослідження в області синапатичної передачі). Двохелектродна фіксація потенціалу застосовується й у цей час, з використанням гострих скляних мікроелектродів, однак навіть із ними ця методика має істотні обмеження: по-перше, два електроди можуть бути уведені тільки в досить велику клітину (наприклад, овоцит жаби).
Дослідження провідності одиночних калієвих і натрієвих каналів під час потенціалу дії проводилися в умовах фіксації потенціалу ділянки мембрани. Спостережувані при цьому принципи роботи окремих каналів відповідають результатам, отриманим раніше в експериментах з фіксацією потенціалу цілої клітки: при деполяризації ймовірність відкриття натрієвих і калієвих каналів зростає. Зростання ймовірності відбувається з тим же тимчасовим ходом, що й відповідні струми в умовах фіксації потенціалу. Так, натрієві канали найбільше часто відкриваються на початку деполяризуючого імпульсу й імовірність таких відкриттів падає в міру розвитку натрієвої інактивації.
Первісний короткочасний викид струму являє собою ємнісний струм, обумовлений зміною заряду на мембрані в результаті зміни мембранного потенціалу. Якщо підсилювач зворотного зв'язку здатний проводити більші струми, то ємнісний струм триває дуже недовго. На практиці викид ємнісного струму триває близько 20 мс, і за ним треба невеликий, але стійкий вихідний струм.
Цей вихідний струм, що протікає через провідності, активні при потенціалі спокою, називається струмом витоку. Здебільшого це струм іонів калію й натрію, що має лінійну залежність від величини зсуву потенціалу фіксації від потенціалу спокою й з на всьому протязі стрибка потенціалу. Більшу частину часу, однак, цей струм замаскований іншими, набагато більшими по величині іонними струмами.
Ходжкін і Хакслі показали, що друга й третя стадії струму обумовлені спочатку входом іонів натрію, а потім виходом іонів із клітини. Їм також удалося виділити індивідуальні компоненти струму й розрахувати їхню величину й часовий хід. Одним із зручних способів домогтися цього послужило видалення з розчину більшої частини іонів натрію й заміна їх на іони холіну (які не проходять через мембрану). Знизивши зміст позаклітинного натрію, удалося домогтися того, що натрієвий рівноважний потенціал зрівнявся з деполяризованим мембранним потенціалом. Таким чином, сумарний струм зрівнявся нулю.
Метод петч-кламп (patch - clamp)
Наприкінці сімдесятих років XX в. Эрвін Неєр (E.Neher) і Берт Сакман (B.Sakmann) виявили, що конусоподібні скляні піпетки з діаметром кінчика 1-2 мікрона можуть утворювати контакти із клітинною мембраною (границі "мембрана - скло") з опором у декілька гігаом - це так званий гігаомний контакт. Він дозволяє ізолювати від зовнішнього середовища й від іншої частини мембрани той її фрагмент, що перебуває усередині піпетки. Відмежований піпеткою фрагмент мембрани й називається patch - "фрагмент", слово clamp (фіксація) у назві методу можна інтерпретувати і як захоплення й ізоляцію цього фрагмента, так й як фіксацію трансмембранного потенціалу в ізольованому фрагменті, або, як буде описано пізніше, потенціалу або струму на цілій клітині. У піпетку, заповнену розчином електроліту, міститься хлор-срібний електрод, другий електрод розміщується позаклітинно, в оточуючій рідини. Відмінність електричної схеми від раніше описаної для двохелектродної фіксації полягає в тім що той самий електрод використовується як для виміру різниці потенціалів, так і для подачі струму.
Величезна сфера, частина якої видна на моніторі в центрі фотографії - це клітина (овцит жаби Xenopus laevіs), що перебуває в цей момент на предметному столику мікроскопа, до нього підведена patch-піпетка, її діаметр у носика - близько 3 мікронів. Після встановлення гігаомного контакту вона ізолює фрагмент мембрани площею приблизно 7 мкм2, струм від іонних каналів у цьому фрагменті можна буде записувати.
Конфігурація "Cell-attached"
Тільки що описана конфігурація називається cell-attached patch-clamp (patch-clamp "із прикріпленою кліткою"). Вона ілюструється схемою 1.
Схема 1. Принципова схема patch-clamp у конфігурації Cell-attached.
Ця конфігурація, однак, має дві незручності. По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати, а, отже, і задавати трансмембранну різницю потенціалів - оскільки обидва електроди - як піпетковий, так і зовнішній, перебувають по одну сторону мембрани. Загалом кажучи, можна, використовуючи оточуючий розчин з іонною композицією, що повторює склад цитоплазми, деполяризувати мембрану поза піпеткою, так що різниця потенціалів між зовнішнім електродом і цитоплазмою зникне, а тоді різниця потенціалів між електродами буде дорівнювати трансмембранному потенціалу - але все це досить приблизно, тому що точний склад цитоплазми нам невідомий.
По-друге, ця конфігурація не дозволяє контролювати склад середовища поза піпеткою - там залишається цитоплазма, склад якої не цілком визначений. У силу цих причин cell-attached mode застосовується досить обмежено.
Конфігурація Іnsіde-out
Однак, якщо піпетку швидким рухом відвести від клітини, то "внутрішній" шматочок мембрани відірветься від клітини й вийде конфігурація іnsіde-out (зовнішня сторона усередині), названа так тому, що внутрішня, звичайно звернена до цитоплазми, сторона мембрани виявиться зовні - в оточуючому розчині, а зовнішня - усередині піпетки. (Схема 2) Альтернативний метод переходу в конфігурацію іnsіde-out полягає в наступному: з конфігурації cell-attached піпетку відводять плавно, формуючи із двох сторін закриту везикулу; потім піднімають піпетку в повітря й опускають у другу ванночку, із внутрішньоклітинним розчином. При переносі зовнішня мембрана везикули руйнується, у результаті формується конфігурація іnsіde-out.
Схема 2. Принципова схема patch-clamp у конфігурації іnsіde-out.
Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани строго дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку заповнюють розчином, що імітує позаклітинне середовище, тоді як оточуючий розчин роблять близьким по складу до цитоплазми. При цьому, міняючи склад оточуючого розчину, можна вивчати, як такі зміни в цитоплазмі впливають на струм каналів, що цікавлять нас, - адже оточуючий розчин контактує із цитоплазматичною стороною мембрани.
Конфігурація Whole-cell
Якщо за умовами експерименту необхідно міняти склад позаклітинного середовища, можна використати конфігурацію whole cell ("англ. ціла клітина"). У цьому випадку піпетку не відводять від клітини, а подають у неї негативний тиск й у такий спосіб руйнують ізольований фрагмент мембрани.
Схема 3. Принципова схема patch-clamp у конфігурації whole-cell.
Після цього піпетка з'єднана із внутрішньоклітинним середовищем; оскільки клітина звичайно маленька, то, завдяки дифузії, склад цитоплазми незабаром виявляється ідентичним складу піпеткового розчину, тому ми, як й у попередньому випадку, знаємо як склад рідин, так і різницю потенціалів. Відзначимо, що якщо в конфігурації іnsіde-out піпетковий електрод був "позаклітинним", а внутрішній - "внутрішньоклітинним", те тепер вони помінялися ролями. З погляду вивчення струму через канали, перевага цього методу полягає в тому, що тут залишаються цілими клітинні структури й регуляторні механізми. Але є й недолік - ми вимірюємо сумарний струм всіх каналів у клітині, а не струми через одиночні канали.
Конфігурація Outsіde-out
Вирішити цю проблему дозволяє конфігурація outsіde-out (зовнішня сторона зовні). Якщо після переходу в whole-cell mode повільно відводити піпетку від клітини, мембрана не відривається відразу, а починає витягуватися в трубку (це видно на фото).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
