10985 (Клонирование животных), страница 3

Кариопласты окружены тонким слоем цитоплазмы (около 10% от всей клеточной цитоплазмы), содержат компактный эндоплазматический ретикулум, несколько митохондрий и рибосом. У некоторых клеточных линий 1/10 кариопластов способна восстановить весь утраченный объем цитоплазмы и восстановиться в жизнеспособные клетки.

Для реконструкции клеток суспензию кариопластов в солевом буфере добавляют к монослою культуры цитопластов из пропорции 100 кариопластов на 1 цитопласт. Цитопласты должны быть уже покрыты инактивированными вирусными частицами. Инкубируют при температуре 4оС 45 минут, а затем еще 45 минут при температуре 37оС. Отмывают раствором Эрла для удаления не слившихся кариопластов [8].

3.2 SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Стив Элледж и неутомимая Мами Ли в очередной раз порадовали научное сообщество оригинальным методом клонирования. Новый метод получил название SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы. Для того чтобы вставить фрагмент ДНК в вектор при помощи классического метода LIC, достаточно смешать вектор и вставку, на концах которых расположены протяженные одноцепочечные участки, комплементарные друг другу. При этом вставка "прилипает" к вектору, образуя рекомбинантную плазмиду с никами в обеих цепях. Полученной плазмидой трансформируют Е.coli, система репарации которой восстанавливает нормальную структуру плазмиды.

Метод SLIC - это то же самое, что и LIC с единственной разницей: "слипание" вектора и вставки проводят в присутствии белка RecA. Эта незначительная модификация метода позволяет добиться достаточно высокого выхода (1 нг. вектора способен дать 3900 трансформантов) а также упростить саму процедуру клонирования. Так если для классического метода LIC необходимо точно подогнать размер одноцепочечных участков у вектора и вставки (чтобы в итоге на стыке вектора и вставки получились ники), то метод SLIC допускает наличие протяженных гэпов [19].

Фактор RecA- один из ключевых факторов репарации и рекомбинации E.coli. Связываясь с одноцепочечным участком ДНК, RecA стимулирует процесс "strand exchange" (в ходе этого процесса одноцепочечный участок одной молекулы ДНК встраивается в гомологичный двухчепоченый участок другой молекулы ДНК, образуя D-петлю). Очевидно, добавление RecA in vitro на шаге клонирования позволяет E.coli эффективнее репарировать плазмиду in vivo.

Для успешного клонирования необходимо наличие 30-ти нуклеотидных участков гомологии по краям вектора и вставки. Получать одноцепочечные участки предлагается с помощью T4 ДНК-полимеразы без добавления нуклеотидов. При помощи SLIC в один вектор можно запихнуть сразу 5 вставок в одну стадию без снижения выхода. Наконец, высокий выход позволяет использовать метод SLIC при клонировании библиотек [7].

3.3 Метод генетического перепрограмирования клеток кожи

Разработан новый метод клонирования – менее трудоемкий, чем способ, благодаря которому была создана овечка Долли. В связи с этим возникли опасения, что однажды он будет использован для обработки эмбрионов человека, дабы формировать детей "по заказу".

Ученые, благодаря этому методу получившие мышат из клеток кожи взрослых особей, обнаружили: такая технология намного более эффективна, чем способ создания Долли, а побочных эффектов у нее меньше – следовательно, она лучше подходит для использования применительно к человеку.

Для клонирования мышей ученые вводили клетки кожи, взятые у взрослой особи, в ткани эмбриона на ранней стадии развития, полученного путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Некоторые из детенышей оказались частичными клонами особей-доноров, а некоторые, как и Долли, стопроцентными.

Однако, в отличие от "метода имени Долли", этот способ настолько прост и эффективен, что возникли опасения: в клиниках, где практикуется ЭКО человека, им могут воспользоваться для помощи бесплодным супружеским парам, которые мечтают о полностью "своем" в биологическом отношении ребенке[11].

Метод предполагает генетическое перепрограммирование клеток кожи, в результате которого они возвращаются в квазиэмбриональное состояние. В прошлом году, когда эта революционная методика впервые была применена к клеткам кожи человека, Католическая церковь и президент Джордж Буш высоко оценили ее как нравственно-приемлемый способ получения эмбриональных стволовых клеток, не сопряженный с необходимостью создавать или уничтожать человеческие эмбрионы [13].

Однако тот же метод уже используется в иных целях – для воспроизводства потомства лабораторных мышей, которое является либо стопроцентными клонами, либо генетическими "химерами" взрослых мышей, клетки кожи которых подверглись перепрограммированию.

Эксперименты на мышах показали, что в принципе теперь возможно взять клетку кожи человека, перепрограммировать ее для возврата в эмбриональное состояние, а затем ввести ее в эмбрион человека на ранней стадии. В результате получится ребенок, обладающий некоторыми общими генами не только с родителями эмбриона, но и с человеком, у которого были взяты клетки кожи.

Такой ребенок является химерой – генетической "помесью" двух или большего числа особей – так как некоторые из его клеток происходят от эмбриона, а другие – от клетки кожи. Фактически у такого ребенка будет три биологических родителя. Известны химеры человека, возникающие в естественных условиях – когда в матке соединяются два эмбриона. Часто подобные люди являются совершенно нормальными и здоровыми. По словам доктора Ланцы, нет причин предполагать, что люди-химеры, созданные при помощи нового метода, будут нездоровы.

Более того, эксперименты на мышах показали, что возможно создавать полные клоны – детенышей, которые на 100% идентичны взрослой особи в генетическом плане. Этого удалось достигнуть, используя разновидность дефективных эмбрионов мышей с четырьмя наборами хромосом вместо нормального числа – двух.

Этот "тетраплоидный" эмбрион, развиваясь, превращался исключительно в плаценту плода; когда же в него ввели перепрограммированную клетку кожи, остальная часть плода развилась из этой единственной клетки и сделалась стопроцентным клоном взрослой особи, кожа которой использовалась [15].

Никто из ученых, разрабатывающих методы перепрограммирования клеток для производства индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem, сокращенно iPS) – так называют эмбриональные клетки – не планирует применять их в репродуктивной медицине человека. Главная цель ученых – наладить производство стволовых клеток для терапевтического лечения таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и инсульт [3].

2. Этические проблемы клонирования животних

Члены Европарламента на пленарном заседании ассамблеи в Страсбурге проголосовали "широким большинством голосов" против клонирования животных в продовольственных целях, сообщил РИА Новости представитель пресс-службы Европарламента.

На сегодняшний день нигде в мире продукты из мяса животных-клонов не продаются, однако, по мнению экспертов, они могут появиться на продовольственных рынках к 2010 году, в частности, в США. В марте комитет по безопасности продуктов питания при правительстве Японии сделал заключение о том, что мясо клонированных коров и свиней безопасно.

Европейское агентство по продовольственной безопасности (EFSA) в январе прошлого года обнародовало предварительное заключение, согласно которому, мясо и молоко клонированных животных пригодно в пищу. Эксперты EFSA, проводившие исследование по поручению Еврокомиссии, считают "очень маловероятным, что существует какое-либо отличие в плане продовольственной безопасности" между мясом и молоком животных-клонов и их сородичей, выращенных традиционным путем.

Независимая Европейская экспертная группа по этике в области науки и новых технологий (EGE), со своей стороны, высказала сомнения в оправданности возможности потребления человеком мяса и молока животных-клонов. Эксперты EGE исходят из того, что подсадка эмбрионов клонов самкам домашних животных является болезненным процессом и зачастую чревата их гибелью, а сами клонированные животные преждевременно стареют и очень уязвимы в плане здоровья.

Решение о разрешении к продаже мяса и молока животных-клонов надлежит принимать Еврокомиссии совместно со странами-членами ЕС [24].

5. Применения клонов животных

Клоны не всегда выглядят одинаково. Хотя у клонов один и тот же генетический материал, окружающая среда так же играет огромную роль в том, как приспособится к ней организм клонированного существа. К примеру, первая кошка, которая была клонирована, ее звали Сиси, была каленкорской породы и была совсем не похожа на свою мать (донора) [21].

Репродуктивное клонирование может позволять исследователям клонировать животных с потенциальной выгодой для областей медицины и сельского хозяйства. Например, те же самые Шотландские исследователи, которые клонировали Долли, клонировали другую овцу, которая была генетически модифицирована, чтобы давать молоко, которое содержит человеческую основу белка для крови . Мы надеемся, что в дальнейшем этот белок может отбираться из молока и подаваться человеку в чистом виде, это очень поможет людям, у которых низкая свертываемость крови. Так же можно использовать животных для того чтобы тестировать на них новые виды лекарств и обычную продукцию, предназначенную для человека. Большое преимущество использования клонированных животных для проверки на таблетки состоит в том, что все они являются генетически идентичными, что означает, что их реакция на таблетки должна быть боле менее сходной, чем у животных с различным генетическим набором.

Другой причиной для клонирования может служить то, что существуют популяции животных, которые стоят на грани вымирания. В 2001 году именно по этой причине ученые произвели первого клона, подвергнутого опасности вымирания - азиатского вола.

Детеныш, который развивался в матке у своей мамы-заместителя погиб всего лишь через три дня после своего рождения. Этот опыт был перенят и уже через два года, в 2003 году, ученые создают клон особи вола, так же стоящего на грани исчезновения. Вскоре 3 африканских диких кошки были клонированы из замороженных эмбрионов, которые были использованы в качестве ДНК. Несмотря на то, что некоторые эксперты считают, что клонирование спасает особи, стоящие на гране вымирания; некоторые ученые считают, что клонирование несет негативный характер, так как все особи имею генетически идентичный набор хромосом, что в целом играет отрицательную роль, так как для выживания разновидности необходимы разные варианты ДНК.

Некоторые люди так же проявили интерес в том, чтобы их умерших домашних любимцев клонировали, надеясь, что эти клоны будут абсолютно такими же как и их умерший донор. Но как показало клонирование Кошки Сиси, клон не всегда выглядит так же, как и его "оригинал", у которого было взято ДНК [4].

Репродуктивное клонирование - очень неэффективная техника и большинство клонированных животных эмбрионов, не могут развиваться в здоровых особях. Например, Долли была единственным клоном, который был рожден живым из общего количества 277 клонированных эмбрионов. Эта очень низкая эффективность, объединенная беспокойствами по поводу безопасности, представляет серьезное препятствие для применения репродуктивного клонирования. Исследователи выявили некоторые проблемы со здоровьем у овцы и других млекопитающих, которые были клонированы. Это увеличение размера плода при рождение и разнообразные дефекты в жизненных органах, типа печени, мозга и сердца. Другими последствиями являются преждевременное старение и проблемы с иммунной системой.

Другая потенциальная проблема заключается в возрасте хромосомы клонируемой клетки. Все клетки проходят их нормальные стадии деления. Кончик хромосомы, который называется теломером с каждым делением укорачивается. Через какое-то время теломер становится настолько маленьким, что клетка не может больше делится, и в конечном итоге погибает. Это обычный процесс старения, который присущ всем типам клеток. Следовательно, клоны, созданные от клетки, принятой от взрослой особи, могут иметь хромосомы, которые уже короче, чем нормальная, и это может повлиять на быстрое старение клонированной особи. И действительно, Долли, которая была клонирована от клетки шестилетней овцы, имела хромосомы, теломеры которого были короче, чем у овец ее возраста. Долли умерла в возрасте 6 лет, приблизительно половина продолжительности жизни овцы, которая составляет 12 лет [27].

6. Эффективность клонирования животных

Клонирование млекопитающих методом переноса ядер сопровождается патологией в эмбриональный, плодный и неонатальный периоды развития клонов. Возможными причинами аномалий у клонированных животных могут быть ошибки репрограммирования генома, повреждение наследственного материала при культивировании эмбрионов in vitro и сама процедура переноса ядер [9].

Значительная часть выживших клонов обладает рядом нарушений, возникающих из-за несоответствующего эпигенетического репрограммирования генома. Суть проблемы заключается в том, что развитие клонированного животного происходит за счет реализации генетической информации, заключенной в хромосомах донорского ядра из дифференцированной соматической клетки, при этом состояние активности разных генов в соматических и эмбриональных клетках значительно отличается. В соматических клетках в активном состоянии находятся гены, характерные для дифференцированной ткани и ответственные за синтез специфических белков. В то же время для развития эмбриона на ранних стадиях требуется, чтобы синтезировались совершенно другие белки, информация о которых закодирована в генах раннего развития.

В процессе естественного полового размножения зигота образуется в результате слияния мужской и женской половых клеток. В процессе гаметогенеза в половых клетках происходит ремоделирование наследственного материала, т.е. его подготовка к дальнейшим процессам оплодотворения и раннего развития. В момент оплодотворения их гены "молчат", с них не происходит считывания информации. Ядро соматической клетки при его переносе в энуклеированный ооцит не "молчит", в нем активно происходят процессы транскрипции (считывания) [21].

Первые успешные опыты по клонированию доказали, что соматическое ядро в цитоплазме ооцита подвергается репрограммированию - процессу переориентирования донорского генома на синтез белков, соответствующих раннему зародышу. Становятся активными те участки хромосом, которые усиленно работают у раннего зародыша. Во многих случаях процесс репрограммирования генома ядерного трансплантата является неполным, что и приводит к ранней остановке развития эмбрионов.