166395 (Исследование расщепления крахмала под действием a-амилазы слюны), страница 2

Биологически активное вещество в дальнейшем было выделено из солода и подверглось детальному изучению. Было обнаружено, что его действие на крахмал происходит через три стадии: разжижение, декстринизацию и осахаривание. Это привело к признанию существования в солоде двух различных компонентов, которые в дальнейшем были получены в отдельности и названы -амилазой (декстринирующий компонент) и -амилазой (осахаривающий компонент).

-Амилазы и -амилазы широко распространены в высших растениях. Наиболее важным источником амилаз являются хлебные злаки, зерно которых в проросшем состоянии (в виде солода) находит широкое применение в промышленном гидролизе крахмала. Солод из ячменя, ржи, пшеницы, овса, проса в настоящее время используются для осахаривания крахмала в спиртовом производстве.

3.4. -Амилазы

Роль -амилаз при гидролизе крахмала исключительно велика. Из трёх основных функций при действии на клейстеризованный крахмал (разжижение, декстринизация, осахаривание) разжижение и декстринизация зависят от -амилаз. Они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный крахмал, разрушая крахмальные зёрна.

-Амилазы различного происхождения имеют много общих свойств: хорошо растворяются в воде или в сильно разбавленных растворах солей. Более концентрированные растворы солей (например 20-30% - ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферментов. -Амилазы легко растворяются в разбавленных растворах этилового спирта, но осаждаются при его концентрации в среде свыше 60%. Белок -амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах рН 4,2 – 5,7. Молекулярная масса солодовой -амилазы 60000, - амилаз микроскопических грибов – 45000-50000. Многие из известных -амилаз получены либо в высокоочищенном, либо в кристаллическом виде.

Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на -амилазы. Это впервые было обнаружено Воллерштейном, затем потверждено Накамурой. В настоящее время это явление отмечено почти для всех амилаз. Однако теоретически этот вопрос применительно к промышленному гидролизу крахмала до сих пор не разработан.

3.5. Гидролиз крахмала -амилазами

-Амилазы действуют на -1,4 –гликозидные связи, расщепляют амилозу внутри её цепи, в результате чего с большой скоростью образуются низкомолекулярные продукты гидролиза – нормальные -декстрины. Их дальнейший гидролиз даёт мальтозу, мальтотриозу и глюкозу. Было найдено, что расщепление -1,4-глюкозидных связей в амилозе носит случайный характер иподчиняется закону статистического распределения продуктов реакции. Расщепление более мелких фракций на последнем этапе амилоза носит уже не случайный характер – действие фермента направлено лишь на определённые -1,4-гликозидные связи. В конечном счёте -амилазы превращают амилозу в мальтозу и глюкозу, хотя и отмечены некоторые несущественные различия в динамике гидролиза этими ферментами указанного субстрата.

Бендецкий, Яровенко по изменению вязкости и восстанавливающей способности гидролизатов крахмала оценивали действие (множественность атаки) -амилазы Bac. Subtilis на растворимый крахмал. Авторы наблюдали существенное различие вязкость –восстанавливающая способность при кислотном и ферментативном гидролизе крахмала. Это дало основание сделать заключение, что при кислотном гидролизе деградация крахмала происходит беспорядочно, а при действии -амилазы осуществляется множественная атака на субстрат, приводящая к образованию олигомеров на первой стадии деградации.

Разрыв цепей амилопектина осуществляется между -1,6 - глюкозидными связями. Отщепление декстринов, содержащих 15 и более гликозидных остатков, идёт с большей скоростью, в то время как конечное осахаривание существенно замедляется. Продукты гидролиза, содержащие -1,4 - глюкозидные связи, являются нормальными -декстринами и состоят из 6-13 глюкозидных остатков. Остаточные декстрины, содержащие большое количество -1,6-связей, обазначаются как аномальные конечные декстрины. Установлено, что -1,6-связи не только не расщепляются -амилазой, но и являются стерическим препятствием для гидролиза -1,4-связей, находящихся в непосредственной близости к -1,6-связям. Наименьшим предельным декстрином в конце гидролиза амилопектина амилазой слюны был найден тетрасахарид, солодовой амилазы – паноза, т. е устойчивым к расщеплению в первом случае были две -1,4-глюкозидные связи, во втором – лишь одна.

На рис. Представлена схема действия -амилаз на амилозу и амилопектин по Бернфельду.

Р ис.2 Действие -амилазы на амилозу и амилопектин по Бернфельду.1 – мальтоза; 2 – глюкоза; 3 – нормальный -декстрин; 4 – конечный -декстрин; *-редуцирующий конец амилозы или амилопектина; - действие -амилазы.

4. Ход работы

Оборудование: электрическая плитка, химические стаканы, колбы, термостойкая колба, термометр, водяная баня, пипетка, мензурка.

Реактивы: крахмал, раствор йода.

Приготовление раствора крахмала:

В термостойкую колбу добавляем 200 мл воды. В неё же добавляем 2 г крахмала. Доводим смесь до кипения и кипятим несколько минут. Таким образом получаем 1% раствор крахмала.

Приготовление раствора слюны:

50 мл воды полощем во рту в течении 3-4 минут.

Проведение эксперимента:

В три пробирки добавляем по 25 мл раствора крахмала и каплю йода. Раствор крахмала окрашивается в интенсивно синюю окраску. Нагреваем электрическую плитку и измеряем температуру водяной бани. В течении 8-10 минут даём время, чтобы температура водяной бани и температура раствора в пробирках уравнялась. Снова измеряем температуру водяной бани. Добавляем в раствор крахмала 5 мл раствора слюны и включаем секундомер. Отмечаем время исчезновения синей окраски. Затем в следующие три пробирки добавляем раствор крахмала и каплю раствора йода, охлаждаем водяную баню и повторяем процедуру при более низкой температуре.

Результаты эксперимента приведены в таблице:

Зависимость скорости расщепления крахмала от температуры.

Можно видеть, что кривая имеет колокообразный характер с максимумом при температуре 37оС. Это подтверждает белковое строение -амилазы, так как при использовании неорганических катализаторов скорость при повышении температуры постоянно возрастает. Также можно видеть, что в нейтральной среде оптимальная работа фермента происходит при 37оС, что совпадает с температурой тела человека.

5. Литература

1. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. «Руководство к практическим занятиям по биологической химии». М.: Высшая школа 1988 г.

2. Жеребцов Н.А. «Амилолитические ферменты в пищевой промышленности». М.: Лёгкая и пищевая промышленность 1984 г.

3. А. Ленинджер «Биохимия». 1976 г.

4. Лещук Р.И., Хило З.В. «Малый практикум по биохимии». Томск 1984 г.

5. Производство и применение амилолитических ферментов в пищевой промышленности. М.: Пищевая промышленность 1968 г.

6. Филиппович Ю.Б. «Основы биохимии». М.: Высшая школа 1985 г.

6. Благодарности

Выражаю благодарность учителю физики Барановой Елене Львовне за помощь в работе и за предоставленное оборудование, ученику 9б класса Косареву Славе за оформление плакатов и ученице 11а класса Овчаровой Наталье за помощь в работе.