Шматочки стегнової кісти разом з періостом або тільки відщиплений періост вирізували із середньої частини діафізу, зони проксимального і дистального метафізів.

Відібраний матеріал фіксували в рідині Карнуа, 10 %-м нейтральному формаліні, 6 %-м формаліні, на насиченому розчині бензойної кислоти, у 80° і 96°-м етанолі при кімнатній температурі і при +4°С. У тих випадках, коли періост вирізували з підлягаючою кістою, відібрані шматочки поміщали в 10 %-й розчин динатриєвої солі етилендіаментетрауксусной кислоти при 18 °С (рН 7,4). Підготовлені зразки заливали в парафін. Гістологічні зрізи (5-6 мкм) офарблювали гематоксилин-еозином по Майеру і по Делафильду, а також селективними методами для виявлення визначених структур; у клітках визначали мітотичний індекс площі кліток, їхній ядерно-плазменне відношення. Числові показники оброблені методами варіаційної статистики.

У личинок на стадії 46 періост починає диференціюватися в діафізарній зоні майбутньої кісти. Перші ознаки периостальних структур з'являються на основі перихондра ще до виникнення тут кісткової пластинки. У цей час у найглибшому шарі перихондра клітини набувають характерного вигляду остеобластів і починають продукувати фермент лужну фосфатазу. Ці ознаки свідчать про початок розгортання периостального остеопластичного процесу. Очевидно, поява перших остеобластів зв'язано з проникненням кровоносних судин у перихондр і остеогенного диференціювання клітин перихондра в локусах, підготовлених до периостальному остеогенезі. Діяльністю цих клітин по окружності діафізарної хрящової закладки у вигляді такого пояса починає формуватися периостальна кісткова манжетка.

Клітини, що мають властивості остеобластів, морфологічно виділяються в новому періості більш великими розмірами, округлим ядром із сітчастою структурою і масивною цитоплазмою зі слабкими оксифільними властивостями. Для них характерна також визначена топографія: вони розташовуються безпосередньо в поверхні закладки і повернені до неї цитоплазматичной масою, тоді як ядро в кожній клітині знаходиться на протилежному кінці. Такий полярний розподіл ядра і цитоплазми додає зрілому функціонуючому остеобластові своєрідний вид комети, поверненої "хвостом" до споруджуваної кісти (мал. 4). Остеобласти, що дозрівають, (преостеобласти) мають більш симетричні контури з центральною локалізацією ядра. Маси цитоплазми в них не перевищує 1/3 її обсягу в зрілих формах. По фронті остеогенеза остеобласти в періості розташовуються в один ряд. Тут майже немає волокнистих структур, фіброзний каркас розташовується трохи вище і зв'язаний безпосередньо з преостеобластичним диференціюванням. Загальна товщина періосту в діафізарній зоні не перевищує 52 мкм.

У метафізарній зоні трубчастої кісти вже на 46-й стадії остеогенезу жаби мається типове для земноводних грибоподібне розростання епіфізарного хряща (мал. 5). У круговій щілині між диафизарной областю кісти, що розвивається, і хрящовим дивертикулом її епіфіза з моменту появи діафізарної кісткової манжетки сусідять на невеликій відстані кіста і хрящ. У цій області зберігається також своєрідна структура, що свідчить не тільки про можливу функціональну сумісність перихондра і періосту, але і про їхню єдність по генезу.

Рис. 4. Перихондр закладки стегнової кістки Rana temporarіa (в області диафиза). Видні остеобласти, що диференціюються, у внутрішньому шарі перихондра (гематоксилін Делафильда - эозин; про. 40, ок. 7).

Рис. 5. Періост області завороту хрящового епіфіза і метафиза стегнової кістки жаби. Між хрящовим епіфізом і кісткою розташовуються скелетогенные клітини (гематоксилін Делафильда - еозин; про. 60; ок. 7).

Перихондрально-періостальна ділянка включає всього 2-3 ряду клітин, з яких внутрішній шар складається з остеобластів, а зовнішній - з хондробластів (мал. 5). У кінцевому верхівковому відділі щілини, куди край кісткової трубки не досягає, утримуються тільки хондробласти.

У личинок 47-й стадії розвитку в трубчастих кістах кінцівок зберігається та ж ситуація, що описана для стадії 46 з тією лише різницею, що перихондральна кісткова трубка в області діафізу має трохи більші розміри по довжині і масі. Якщо на попередній стадії зачаток кісткового діафізу мав вигляд на гістологічному зрізі як тонка (10-12 мкм) пластинка, то на стадії 47 вона досягає в товщину 24 мкм і вже містить у своєму складі одиничні остеоцити (включені в кісту остеобласти) (мал. 6). У центральній частині діафізу остеобласти періосту здобувають подовжену форму і подовжнє розташування без вираженого полярного орієнтування до фронту остеогенеза (мал. 6). Зміна форми в остеобластах, як правило, сполучено з їхньою функціональною активністю (Мажуга, 1978; Вечерська, 1984).

Можна думати тому, що в серединній зоні діафіза кістки, що розвивається, остеопластичний процес здобуває поступово меншу інтенсивність, чим у метафізах.

Рис. 6. Періост центра диафиза стегнової кісти R. temporarіa на 47-й стадії розвитку. Відзначаються одиничні остеоцити в периостальній кістці (гематоксилін Майера - еозин; про. 40, ок. 7).

Рис. 7. Періост зони діафіза кісти жаби на 49-й стадії розвитку. Відзначається вогнище енхондральної резорбції, у якому вже помітні зачатки миєлогенного ретикулума (гематоксилін - еозин; про. 40, ок. 7).

Клітини другого (зовнішнього) ряду морфологічно більш різнорідні. Серед них зустрічаються преостеобластические стадії з порівняно великим ядром. І ті й інші зв'язані з коллагеновым каркасом, утвореним, очевидно, їхньою участю.

Кількісний розподіл кліток у різних зонах періосту характеризується наступними показниками: у діафізарної області протягом 340 мкм утримується 11 остеобластів і 10 фібробластоподібних кліток.

У личинок трав'яної жаби 49-й стадії розвитку в стегновій кісті помітне насамперед збільшення в її розмірах по довжині й у поперечнику. Перихондральна кісткова трубка добре сформована. У центрі діафіза в хрящовому стрижні до цього часу з'явилося вогнище енхондральної резорбції, у якому вже помітні зачатки мієлогенного ретикулума (мал. 7). У проксимальному і дистальному відділах хрящового стрижня чітко виступає зональна диференціювання хондроцитів, у зв'язку з чим по довжині хрящового стрижня виділяються території: епіфізів, пролиферируючих хондроцитів, гіпертрофованих хондроцитів, що відрізняються своєї цитоархітектонікой.

Періост також здобуває в масі переважно за рахунок збільшення кількості остеобластів, що розташовуються, як правило, у два ряди, і фібробластоподобних клітин. Цей показник відповідає помітної інтенсифікації остеопластичного процесу в зв'язку з прискоренням темпів росту кісткової ланки і кістяка в цілому. Товщина періосту зберігається більш-менш рівномірної на всьому протязі і складає приблизно 50 мкм.

На початковій стадії метаморфоза личинки трав'яної жаби мають уже сформовані трубчасті кісти в тазовій кінцівці. Періост у них зберігає вид порівняно тонкої по масі структури, що включає 3 (не більш 4) ряди клітин, укріплених фібриллярним каркасом. Помітною ознакою, що з'явилася до цього часу в періості, виступає не стільки його загальна структура, скільки стан клітин. На відміну від періосту в личинок жаб на цій стадії онтогенезу остеобласти в періості здобувають форму подовжених кліток із щільним штриховидним ядром (мал. 8). Фактично клітки, що обмежують фронт периостального остеогенезу, за формою мало відрізняються від більш поверхово розташованих клітин періосту. Такий метаморфоз остеогенних клітин зв'язаний, очевидно, з переходом періосту в стан зрілого дифінітивного тихорєцького диференціювання, для якої подовжена форма остеогенних клітин є звичайною. Якби зміни у формі остеобластів були сполучені зі зниженням інтенсивності остеопластичного процесу, то вони проявилися б у різних ділянках періосту нерівномірно, оскільки периостальний остеопластичний процес відбувається в різних зонах кістки з неоднаковою інтенсивністю. Про це ж свідчить і чисто кількісний показник розподілу остеобластів. Незважаючи на зміну форми, їхня кількість на еквівалентній довжині періосту залишається в межах 9-10 одиниць на 34 мкм.

Рис. 8. Періост проксимального метафиза стегнової кісти жаби після завершення метаморфоза. Видні подовжені за формою остеобласти (гематоксилін Майера - эозин; про. 40, ок. 7).

Рис. 9. У сформованій стегновій кісті статевозрілої R. temporarіa окістя представлене одношаровою структурою (гематоксилін Майера - эозин; про. 90, ок. 7).

Природно, виникає питання: яким шляхом поповнюється склад остеогенних клітин у періості? На гістологічних зрізах довгих кіст трав'яної жаби личинокових стадій розвитку в періості ми завжди знаходили клітки в стані мітозу. Частка цих кліток невелика: серед остеобластів мітотичний індекс не перевищує 0,2 %, а для кліток менш диференційованих (у зовнішньому шарі) він досягає 1,0-1,5 %. З цих спостережень можна припустити, що періост самопідтримується тканинними системам. Поповнення кліток у ньому відбувається переважно за рахунок менш диференційованих станів і частково за рахунок функціонально зрілих остеобластів.

З початком метаморфоза, коли стегнова кіста в зростаючій кінцівці вже майже сформована, періост у діафізарної області переходить у зрілий стан і його клітки, включаючи остеобласти, здобувають компактну-подовжену форму з порівняно дрібним щільним ядром також подовженої форми. У структурі періосту до цього часу підсилюється колагеновий волокнистий каркас, і весь періост стає більш щільним і міцним. Зрілий періост можна тому, додаючи визначене зусилля, відокремити від кісти у виді тонкої плівки, чого не можна зробити з періостом тільки формується, при такій спробі він звичайно руйнується.

У кістках, що закінчили ріст, або в періоди сезонного припинення росту клітки періосту стають морфологічно однотипними (мал. 9). Серед них не зустрічаються з ознаками функціонуючих остеобластів, хоча всі клітки такого періосту є потенційно остеогенними. При зміні умов у ньому можуть активізуватися остеопластичні функції з появою морфологічно ідентифікованих остеобластів у зонах поновлення процесів ремоделювання кістки або її росту.

З цієї причини в дорослих жаб у період літнього активного стану завжди виявляються зональні особливості в структурі періосту, кількості в ньому клітинних рядів, а також формі і розмірах самих клітин. При цьому в діафізарної області структура періосту істотно не змінюється, оскільки периостальний ріст кістки в діафізі в дорослих жаб практично припиняється.

Таким чином, у ростучих кістках скелету амфібій окістя представлене складною структурою, що складається з остеогенних клітин, що знаходяться на різних стадіях диференціювання. У кістках сформованого і ріст кістяка, що закінчився, вона перетворюється в одношарову структуру, що складається з зовні однотипових фібробластоподобних клітин.

Розділ 3. Пролиферативні властивості клітин окістя в амфібій

У спеціальній літературі є нечисленні загальні відомості про розвиток кістяка довгих трубчастих кісток в амфібій (Кащенко, 1896; Eggelіng, 1911; Lubosch, 1928; Румянцев, 1958; Житников, 1980; Домашевская, 1984, 1989). При цьому фактично відсутня інформація про проліферативних потенції кліток окістя, що відіграє велику роль в апозиційному рості кістки. Для більш повного з'ясування особливостей росту і розвитку кістяка в амфібій представляється важливим вивчення не тільки структури окістя, але і проліферативних потенцій її клітин.

Дослідження проводили на личинках, маса яких складала 4-5 м, і на однорічних часночницах (Pelobates fuscus). ³Н-тимидин уводили внутрішньочеревно однократно в дозі 74 кбк/м живої маси з наступною фіксацією періосту з підлягаючим шаром компакт стегнової кістки в 10 %-м нейтральному формаліні через 1; 24 і 48 год. (личинки) і через 1; 24 і 72 год. (жабенята).