10366 (Постсинаптическая трансформация сигнала)

Постсинаптическая трансформация сигнала

Введение

Активность нервных окончаний регулируется двумя экзогенными факторами – изменением мембранного потенциала и прямым взаимодействием медиаторов нервных импульсов с рецепторами. В результате этих событий меняется цитоплазматический уровень по меньшей мере вторичных посредников – Са⁺, цАМФ, цГМФ, инозитолтрифосфата и диацилглицерина, что приводит к активации соответствующих пулов протеинкиназ: цАМФ-зависимых протеинкиназ; цГМФ-зависимых протеинкиназ; Са-кальмодулин и Са-фосфолипид-зависимых протеинкиназ. Активация протеинкиназ обусловливает фосфорилирование регуляторных белков-мишеней в клетках нервной системы и тем самым модулирует функциональную активность этих клеток.

Определяющий вклад в проблему внутриклеточной регуляции был сделан в 50–60-е годы Э. Сазерлендом, сформулировавшим представление о роли циклических нуклеотидов как вторичных посредников, накапливающихся в клетке в ответ на нейромедиаторный или гормональный стимул и осуществляющих связь между рецепторами и исполнительными системами. В результате дальнейшего развития этих исследований оказалось, что циклический аденозинмонофосфат регулирует обмен белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, влияет на проницаемость мембран, электрическую, сократительную и секреторную функции клеток, дифференцировку и пролиферацию. Установлена роль фосфорилирования белков как основного пути действия этого нуклеотила на клетки животных. Найдена связь между содержанием циклических нуклеотидов и характером протекания некоторых патологических процессов в тканях. Описано участие цАМФ и цГМФ в проявлении действия многих лекарственных препаратов на организм. Спустя лишь 10–15 лет после открытия, сделанного Э. Сазерлендом, представления о роли и механизме действия циклических нуклеотидов оказались неотделимыми от современной биохимии, физиологии и медицины. Задача настоящей работы состоит в сравнительно детальном рассмотрении постсинаптических механизмов.

1. цАМФ-Зависимое фосфорилирование

1.1 Аденилатциклаза, ее активация

Синтез в клетке цАМФ из АТФ осуществляет аденилатциклаза. Фермент обнаружен практически во всех тканях млекопитающих. Максимальная активность аденилатциклазы выявлена в мозге, далее в порядке убывания активности фермента ткани можно распределить следующим образом: селезенка, скелетные мышцы, сердце, легкие, почка, печень, жировая ткань. Аденилатциклаза локализована почти исключительно в плазматических мембранах, хотя есть сообщения о присутствии фермента в митохондриальной и микросомальной фракциях.

Аденилатциклаза представляет собой мультимолекулярный комплекс, состоящий из рецепторного и каталитического компонентов. Ответ клетки на действие гормона или биологически активного вещества зависит от концентрации рецепторов на поверхности мембраны и степени сопряжения рецепторов с аденилатциклазой. В последнем случае в роли сопрягающего компонента выступают G-белки, обладающие как ГТФ-связывающей, так и ГТФ-гидролизующей активностью.

Рецептия с участием G-белков отличается от других известных систем трансформации внеклеточного сигнала. Все эти системы включают рецептор – дискриминатор сигнала, с высокой специфичностью и чувствительностью "снимающий" внеклеточный сигнал с наружной мембраны. Рецептор может находиться внутри клетки – в том случае, если эффекторы являются липофильными молекулами, легко проникающими через мембрану. Рецепторы для водорастворимых эффекторов встроены в наружную мембрану: эти рецепторы могут быть ферментами; другой тип мембрановстроенных рецепторов сопряжен с ионными каналами. Наконец, рецепторы, которым не присущи свойства ни канала, ни фермента, сопряжены с ферментами-исполнителями с помощью G-белков.

Регуляцию аденилатциклазной системы с участием G-белков можно представить следующим образом. В системе есть два белка, состоящих из субъединиц а, р и у и названных G_s и Gj. р – у-субъединицы в отличие от а-субъединиц практически идентичны во всех изученных G-белках. а-субъединица содержит участок связывания с гуаниловыми нуклеотидами и обладает ГТФазной активностью. Каждый из G-белков связан со своим рецептором. При образовании комплекса агонистрецептор происходит активация G-белка путем замены в нуклеотидсвязывающем центре ГДФ на ГТФ. При этом изменяется конформация а-субъединицы, что обусловливает ее диссоциацию от комплекса ру. Для диссоциации необходим Mg⁺. Активированная а-субъединица G| ингибирует активность аденилатциклазы, в то время как активированная G_s – стимулирует ее.

Очевидно, почти идентичные по структуре комплексы Ру могут ингибировать аденилатциклазу непрямым способом, а именно, путем связывания с ct-субъединицей G_s, таким образом "выключая" ее способность стимулировать фермент. Действительно, во многих исследованных тканях, в том числе в нервной, концентрация Gj значительно выше, чем G_s. Следовательно, возможно высвобождение достаточного количества комплекса Ру из G_i для соединения со всеми а-субъединицами G_s. Сопрягающий эффект G-белков прекращается медленным гидролизом связанного ГТФ до ГДФ. G-белки могут быть снова активированы при связывании рецептора с "сигнальной" молекулой.

Установлено, что рецепторы многих гормонов собраны в группы, кластеры и малоподвижны в мембране. Поэтому при активации кластера, состоящего из рецепторов одного типа, происходит стимулирование аденилатциклазы и увеличение уровня цАМФ в ограниченном районе клетки. Это ведет к повышению протеинкиназной активности и фосфорилированию субстратов только в данной зоне клетки, в данном компартменте. Компартментализация цАМФ и А-киназы установлена во многих типах клеток: например, стимуляция сердца как с помощью катехоламинов, так и простагландина Ej приводит к увеличению уровня цАМФ и активации протеинкиназы А. Однако катехоламины и простагландин Ej оказывают различное влияние на фосфорилирование фосфорилазы гликогена. Видимо, рецепторы катехоламинов и простагландина и соответствующие постсинаптические системы расположены в разных компартментах клетки.

1.2 Протеинкиназа

Через 10 лет после открытия Сазерлендом цАМФ была обнаружена цАМФ-зависимая протеинкиназа, значительно повышающая скорость фосфорилирования субстратов в присутствии цАМФ. Реакция протеинфосфорилирования выглядит следующим образом:

Гидроксильная группа белка, акцептирующая терминальный фосфат АТФ, почти всегда принадлежит серину, реже – треонину и тирозину. Фосфосериновые остатки в белках существенно ионизированы при физиологических значениях рН, поэтому фосфорилирование или дефосфорилирование серина резко меняет заряд белковых молекул. После открытия протеинкиназы А стало ясно, что реакции фосфорилирования – дефосфорилирования опосредуют действие многих гормонов и нейромедиаторов, которые через р-адренергическую рецептию активируют аденилатциклазу и приводят к повышению внутриклеточного уровня цАМФ.

Протеинкиназа А обнаружена во всех нормальных клетках млекопитающих, а также в некоторых типах клеток немлекопитающих. Высоким уровнем протеинкиназы А отличается мозг, где фермент распределен равномерно по всем отделам. Для проявления активности фермента необходимы ионы магния. Так, из легких кролика выделен стимулирующий модулятор протеинкиназы, связывающий магний и названный "магмодулином". Протеинкиназа А – тетрамер, построенный из двух различных субъединиц: регуляторной, связывающей цАМФ, и каталитической, осуществляющей фосфотрансферазную реакцию; будучи соединены вместе, они образуют неактивный комплекс. При активации происходит связывание цАМФ Р-субъединицей холофермента, после чего возможна диссоциация Р от К-субъединицы. Свободная К-рубъединица способна катализировать фосфорилирование различных клеточных белков:

Таким образом, в активном состоянии протеинкиназа А представляет димер Р-субъединиц, связанный с 4 молями цАМФ, и 2 свободные К-субъединицы.

Скорость обратной реакции обусловлена не только спонтанной диссоциацией комплексов Р – цАМФ, но и концентрацией К-субъединиц, так как последние высвобождают связанный цАМФ путем рекомбинации с комплексом Р – цАМФ. Этот своеобразный "ретрокооперативный" эффект К-субъединицы, названный так Свилленсом и Дюмоном, ведет к временному увеличению концентрации цАМФ, требуемой для активации протеинкиназы. В период стимуляции системы уровень К-субъединиц резко падает.

Существование эквивалентных количеств каталитических и регуляторных субъединиц цАМФ-зависимой протеинкиназы во многих тканях привело к представлению о том, что единственная функция регуляторной субъединицы – контроль протеинкиназной активности. Однако регуляторная субъединица может существовать отдельно от каталитической в некоторых типах клеток, например в клетках нейробластомы. Это указывает на возможность проявления биологического действия регуляторной субъединицы независимо от каталитической. Далее будет рассмотрена такая возможность на примере изменения проницаемости мембран нейронов для Na⁺ и К в присутствии Р-субъединицы. Надо также иметь в виду, что цАМФ-связывающие белки, не ассоциированные с протеинкиназой, могут регулировать активность последней путем модулирования уровня свободного циклического нуклеотида, способного присоединяться к протеинкиназе.

Отметим далее, что свободные Р-субъединицы ингибируют фосфодиэстеразу цАМФ, что может приводить к увеличению уровня этого нуклеотида в клетке. Установлено также, что свободные Р-субъединицы протеинкиназы типа А в отличие от холофермента киназы и ее К-субъединицы ингибируют фосфопротеинфосфатазы нескольких типов. Ингибирование обусловлено снижением скорости катализа без изменения сродства к энзиму. Очевидна физиологическая значимость такого ингибирования, так как в этом случае диссоциация А-киназы может способствовать не только стимулированию фосфорилирующей активности, но и ингибированию дефосфорилирования субстратов.

Протеинкиназа А существует в форме двух изоферментов, относительное количество которых варьирует в разных тканях.

Изоферменты были названы киназами I и II. Они имеют различные скорости диссоциации в присутствии гистона и растворов NaCl и реассоциации после удаления цАМФ. Так, киназа I типа быстро диссоциирует в присутствии гистона или 0,5 М NaCl и медленно реассоциирует после удаления цАМФ; напротив, киназа II типа медленно диссоциирует в присутствии указанных агентов и быстро реассоциирует после удаления цАМФ.

Каталитические субъединицы киназ I и II типа имеют молекулярную массу 40 кД и минимальные различия в аминокислотном составе. Напротив, регуляторные субъединицы киназ I и II типа значительно отличаются по первичной структуре. Вероятно, субъединица Р I типа – 49 кД – является протеолитическим фрагментом Р II типа с молекулярной массой 55 кД. Один из сериновых остатков Р-субъединицы II типа фосфорилируется каталитической субъединицей цАМФ-зависимой протеинкиназы. Очищенная же Р-субъединица I типа не фосфорилируется каталитической субъединицей цАМФ-зависимой протеинкиназы. Другим отличием киназы I типа от II типа является то, что только первый фермент связывает Mg-АТФ с высоким сродством.

цАМФ-зависимые протеинкиназы локализованы в основном в цитозольной фракции клеток. Однако в мозге, например, значительная часть киназы II типа является мембранно-связанной. Очевидно, субклеточная локализация и соотношение киназ I и II типа могут обусловливать специфику действия цАМФ в клетке. Отношение киназы I типа к киназе II типа варьирует в различных органах и в различных фазах клеточного цикла.

При исследовании локализации фосфорилирующих систем в ЦНС установлено, что цАМФ-зависимая система избирательно сконцентрирована в нейронах, особенно в дендритах, а не в глии. Мозг крысы содержит как I, так и и II форму протеинкиназы А при соотношении этих форм 1:4 соответственно. Высокое содержание А-киназы II типа по сравнению с ферментом I типа вообще характерно для нервной ткани. Недавно установлена гетерогенность Р-субъединиц А-киназы II типа. При этом в мозге выявлена собственная, специфичная Р Н-субъединица, отличная по иммунохимическим свойствам от Р-субъединиц II типа в других тканях. Р II мозга отличается от Р II – мышц по характеру взаимодействия с К-субъединицей, а также по электрофоретической подвижности аутофосфорилированных форм. Показано, что фракция Р-субъединиц II типа мозга взаимодействует с Са⁺ и кальмодулином. Необычные свойства Р Н-субъединицы мозга могут являться следствием адаптации нервных клеток к специфической функции передачи и хранения информации.

Ассоциации А-киназы II типа мозга с мембранной фракцией клеток обусловлены только Р-субъединицей. цАМФ при диссоциации холофермента высвобождает из мембранно-связанного состояния только К-субъединицу; таким образом, компартментализация К-субъединицы изменяется при активации А-киназы. Молекула этой субъединицы гидрофильна, поэтому диссоциация мембранно-связанной А-киназы II типа приводит к транслокации каталитической субъединицы в цитоплазму и далее в ядро. Предполагается, что такая транслокация может обусловливать цАМФ-зависимое изменение экспрессии генов в нейронах, наибольшая концентрация Р-субъединиц А-киназы II типа обнаружена в пре- и постсинаптической мембранах, что свидетельствует о важной роли этой киназы в синаптической передаче.

Различия между регуляторными субъединицами А-киназы II типа нервной и других тканей проявляются также и во взаимодействии этих субъединиц с субстратами киназы. Так, для Р-субъединицы II типа из мозга характерно тесное взаимодействие с МАР-2 – нейроспецифическим белком, локализованным в отростках нейронов, кальцинейрином и другими белками. Такое взаимодействие Р II с субстратами А-киназы может приводить, с одной стороны, к локализации А-киназы II типа около специфических субстратов и, соответственно, в определенных внутриклеточных компартментах, что, очевидно, имеет важное физиологическое значение. С другой стороны, кроме связывания К-субъединицы Р-субъединица II типа нервной ткани может участвовать в регуляции функционирования других белков.

Регуляция активности протеинкиназы А осуществляется несколькими путями. Так, во многих тканях, в том числе и нервной, обнаружен низкомолекулярный термостабильный ингибитор киназы. Ингибитор связывается со свободной К-субъединицей и угнетает ее ферментативную активность. Вероятно, физиологическая роль ингибитора состоит в блокаде фосфорилирующей активности при "базаяном", т.е. нестимулируемом уровне цАМФ. В мозге наблюдается изменение концентрации ингибитора в ответ на некоторые гормональные сигналы, что может иметь определенное значение в долговременной регуляции активности А-киназы. Регуляция активности киназы II типа осуществляется также аутофосфорилированием ее Р-субъединицы; это ведет к повышению активности фермента, что обусловлено уменьшенной скоростью реассоциации фосфорилированной Р со свободной К-субъединицей. Киназа I типа также может быть фосфорилирована, но фосфорилирование ее Р-субъединицы осуществляется цГМФ-зависимой протеинкиназой. Установлено ау-тофосфорилирование К-субъединицы, однако функциональное значение этого процесса неизвестно.

Возможно, что фосфорилирование с помощью свободной К-субъединицы А-киназы и соответствующая активация фосфопротеинфосфатазного ингибитора I, приводящая к снижению активности фосфопротеинфосфатазы I, уменьшает дефосфорилирование комплекса Р-цАЛ1Ф и, следовательно, способствует диссоциации киназы II типа по принципу положительной обратной связи. Такое событие наряду с компартментализацией цАМФ в клетке может способствовать эффективной активации цАМФ-зависимой киназы при незначительном увеличении внутриклеточного уровня цАМФ.