123196 (Изучение свойств бактериальной суспензии и ее применение в подготовительных процессах переработки мехового сырья), страница 6

Первоначально производят калибровку прибора, для этого устанавливают «режим» - 0 (калибровка прибора); «вывод» - 0. Белую пластину помещают на место отражающего образца; черную – на место измеряемого образца, нажимают «пуск », после загорания «Б» извлекают черную пластину. Снова нажимают «пуск», загорается «I» извлекают белую пластину. Устанавливают на индикаторе «режим» - 1; «вывод» - 0 (измерение прозрачных проб) на место прозрачного образца – дистиллированную воду, нажимают пуск.

Для измерения рабочего образца устанавливают пробу. Нажимают «пуск»,

3. Экспериментальная часть

При обработке пушно-мехового и овчинно- шубного сырья на предприятиях меховой промышленности образуется значительное количество сточных вод, характер которых определяется спецификой технологических процессов, осуществляемых в конкретном производстве. Сточные воды образуются после проведения основных жидкостных процессов: отмока, обезжиривание, пикелевание, дубление, крашение и т.д.

В них содержатся химические материалы, как вносимые для проведения технологического процесса, так и образующиеся в результате переработки мехового сырья. Так, после обезжиривания шкур овчины, сточные воды наряду с поверхностно-активными веществами, формальдегидом содержат значительное количество жировых веществ.

В настоящее время все большее применение находит биологическая очистка, основанная на способности микроорганизмов использовать загрязнения в качестве источников питания в результате своей жизнедеятельности. В связи с этим, целью дипломной работы являлось изучение свойств микроорганизмов, выделенных из жировых материалов и из сточных вод после процесса обезжиривания, исследование деструкции жиров на основе метода потенциометрического титрования, а также возможности применения бактериальной суспензии этих микроорганизмов в процессе обезжиривания меховой овчины.

3.1 Изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, деструктирующих жировые вещества

Для изучения морфологических и культуральных свойств микроорганизмов методом разведений на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана (п.2.2.1), в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир, были выделены чистые культуры микроорганизмов в чашках Петри (п.2.2.2-2.2.3). Культивирование проводили в термостате при температуре (37±0,5)˚С в течение 24. Выделенные культуры были обозначены как: Нв – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; Н – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В – выделенные из шерстного жира; 3,7– культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.

По методам Грама, Трухильо (наличие спор), Леффлера (количество жгутиков) (п.п. 2.2.4), были изучены морфологические свойства путем окрашивания и микроскопирования мазков колоний.

Результаты изучения морфолого-культуральных признаков бактерий представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур

Микроскопированием окрашенных мазков выявили, что все культуры грамотрицательные, расположение жгутиков перетрихиальное, спор не имеют. Культуры типа 3, 7 представляют собой палочки, сцепленные между бактерий; культуры типа Н, Нв и В по форме были отнесены к коккобактериям - мелким палочкам, близким к овальной форме.

Все культуры имеют точечные круглые колонии грязно–белого цвета, непрозрачные, матовые, с ровными краями, структура колоний однородная, профиль выпуклый.

Для изучения подвижности микроорганизмов была рассмотрена раздавленная капля бактериальной суспензии (п.2.2.6), в результате чего отмечено хаотичное движение бактерий, обусловленное перетрихиальным расположением жгутиков.

Ферментативная способность выделенных культур была определена на основе исследований протеолитической активности (п. 2.2.9), редуцирующей способности (п.2.2.13), анализа на индолообразование (п. 2.2.10), наличие сероводорода (п. 2.2.11), аммиака (п. 2.2.12), каталазы (п.2.2.14).

Результаты исследований, представленные в таблице 2, показали положительную реакцию для всех культур на наличие аммиака, на сероводород и каталазу - отрицательные. Изучение протеолитической активности показало, что все культуры растут без разжижения желатина, не выделяют индол и не обладают редуцирующей способностью, что свидетельствует о низких протеолитических свойствах исследуемых микроорганизмов.

Для изучения биохимической активности бактерий были проведены тесты на способность микробов к ферментативному расщеплению сахаров. В качестве субстратов, для определения ферментативной активности использовались такие сахара, как мальтоза, галактоза, глюкоза, сахароза. Расщепление может происходить на альдегиды, газообразные продукты, кислоты для этого был произведен посев культур на специальные среды с углеводами (п.2.2.15).

На жидкие среды, содержащие различные сахара, был произведен посев по 0,1 см³ суспензии клеток и термостатирование в течение 48 ч при температуре (37±0,5)˚С. Наблюдения показали, что уже к 24 ч окраска сред изменилась от желтой до ярко малиновой и изменение рН.

Для определения липолитической активности был произведен посев на бульон Штерна (п.2.2.16), содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре, затем производили смыв полученной биомассы 10 см³ бульона Штерна, и термостатировали при температуре (37±0,5)˚С в течение 96 часов.

На протяжении от 24 до 96 часов культивирования наблюдалось изменение окраски среды, помутнение, наличие пузырьков у поверхности среды, образование осадка и пленки. Уже к 24 часам культивирования было отмечено розовение окраски для всех сред, зараженных культурами. К 48 ч характерно образование пристеночного кольца на поверхности жидкости интенсивной розовой окраски. К 72 ч наблюдалось полное обесцвечивание растворов.

На основании проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, что связано с вовлечением нерпичьего жира (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что подтверждается переходом окраски бульона из оранжевой в красную и изменением активной реакции среды.

3.2 Изучение деструкции жиров методом потенциометрического титрования

Метод основан на исследовании взаимодействия веществ с протонами потенциометрическим титрованием.

Кривые титрования позволяют:

- определить природу и число ионогенных групп в молекуле жира

- изучить влияние добавок щелочей на ионизацию эфирных групп жира

- оценить глубину и специфичность реакций жиров с микроорганизмами

- количественно определить деструкцию жиров.

Кривые титрования показывают зависимость числа связанных протонов омыленными жирами от рН среды. Величина рН измеряется непосредственно на приборе, число связанных протонов вычисляется. Число связанных ионов определяется по разности между общим числом добавленных ионов и числом свободных ионов в растворе.

Для изучения деструкции были выбраны следующие жиры: нерпичий, сульфатированный рыбий, шерстный, свиной и Tanning oil. Навеску жира, около 1г, взвешенную на аналитических весах, помещали в коническую колбу, в которой проводили щелочной гидролиз (п. 2.2.23), количественно переносили в мерную колбу на 250 см³ и объем доводили до метки дистиллированной водой. Затем отбирали пробу разбавленного гидролизованного жира 4 см³, переносили в стакан на 50 см³ и добавляли 33 см³ дистиллированной воды, для того чтобы мембрана стеклянного электрода была погружена в раствор. Измерение проводили на приборе рН-метр «Анион 7051» путем фиксирования значений рН раствора при добавлении по 0,1 см³ 0,1 н. раствора соляной кислоты. Параллельно проводили титрование раствора чистой щелочи (5 см³ 30% раствора NaOH переносили в мерную колбу на 250 см³, доводили до метки дистиллированной водой, для анализа брали 4 см³ раствора) и воды. При титровании соли жирной кислоты раствором кислоты происходит реакция обмена с образованием кислоты и соли:

RCOONa + HCl → RCOOH + NaCl

При титровании происходит помутнение раствора в момент образования жирной кислоты.

Для построения кривой титрования проводили расчет параметров по следующим формулам:

B = (C_Н * V₁)/(V₁+V) * 1000, где (1)

B – объем HCl, который добавлен к 100 см³ воды

C_Н – нормальная концентрация кислоты

V₁ – добавленный объем,см³

V – начальный объем раствора,см³

C = (- lg B) (2)

D – экспериментальное значение рН

Строим график зависимости C от экспериментальных значений рН (находим формулу по линии Тренда, для подстановки в W)

Для изучения деструкции жира микроорганизмами предварительно были приготовлены бактериальные суспензии в колбах Эрленмейера на основе жидкой синтетической среды (п.2.2.8), содержащей около 1 г жира, объемом 200 см³ каждая. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате марки (ТС-80М-2) при температуре (375)С, осуществляя переменное механическое воздействие, на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки в течение 48 часов. После чего проводили гидролиз содержимого колбы (п.2.2.23), переносили в мерную колбу на 250 см³, доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Затем отбирали объем пробы в количестве 4 см³ в стакан на 50 см³, добавляли 33 см³ дистиллированной воды. Титровали 0,1 н раствором соляной кислоты по 0,1 см³ на приборе рН-метр «Анион 7051» при температуре 20,6 ºС. При каждом объеме добавленной кислоты фиксировали значение рН и строили графики зависимости рН от объема и количество функциональных групп (N) от значений рН.

Пример расчета параметров для построения кривых титрования жира при добавлении 3 см³ кислоты (сульфатированный рыбий жир):

B = (0,1 * 3)/(3+33) * 1000 = 8,33

C = (- lg 8,33) =0,9208

D = 12,33 (экспериментальное значение рН)

F = 3мл (количество с известной концентрацией раствора реагента, добавленное к раствору жира, см³)

G = 0,057(объем HCl, который добавлен к водному раствору жира, см³)

H = (-lg G) = 1,243

Строим график зависимости lg B от экспериментальных значений рН для воды (находим формулу по линии Тренда, для подстановки в W)

Рисунок 3- Кривая титрования воды 0,1н раствором соляной кислоты

Находим значение W при подстановки значений H в формулу, полученную по линии Тренда, вместо Х

-0,1233Х+3,6351=-0,1233*1,243+3,6351=3, 658

W = 3,658

J = 12,33

K = W- J = 3,658-12,33 = -8,061

L = 8,67

M = 1

N = (0,057*1*10)/0,139 =4,1109

Остальные расчетные данные представлены в таблице 4

Для определения количества групп СООН строим графики в координатах количество функциональных групп – рН.