1625912753-65e6da6a77981678ec57885d9870b7c6 (K2)

К-2. Кинетика гидролиза n-нитрофенилфосфата щелочнойфосфатазой

Приборы и реактивы:

-термостат (30⁰С)
-секундомер
-спектрофотометр
-кювета с длиной оптического пути 1 см
-пипетки на 1; 2; 5 и 10 мл
-ванночка со льдом для хранения раствора фермента
-0,02 М раствора NaOH
-раствор фермента с активностью 0,1 ФЕ/мл
-0,05 М глициновый буфер, рН 10, содержащий 5*10^-4 М MgSO₄ (раствор В)
-0,01 М раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 глициновом буфере, рН 10, содержащем 5*10^-4 М MgSO₄ (раствор А)

Химическая реакция:

Экспериментальная часть:

а) Приготовление рабочих растворов субстрата
Необходимо приготовить рабочий раствор А, содержащий 0,05 М глициновый буфер, рН 10, содержащий 5*10^-4 М MgSO₄ (раствор В) и 0,01 М раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 глициновом буфере, рН 10, содержащем 5*10^-4 М MgSO₄ (раствор А). Растворы готовили исходя из раствора А, разбавляя его раствором В так, чтобы объем рабочего раствора составлял 5 мл.

б) Измерение скорости гидролиза n-нитрофенилфосфата
Методика:
В пробирку налили 4,5 мл рабочего раствора и поместили в термостат (30⁰С) на 10 минут. В пробирку с рабочим раствором, находящимся в термостате, внесли 0,5 мл раствора фермента, перемешали, включив секундомер. На протяжении всего эксперимента пробирку с рабочим раствором не вынимали из термостата.
Через 2; 5; 10 и 15 минут от начала реакции из реакционной смеси отобрали пробы по 1 мл, быстро влили их в пробирки с 9 мл 0,02М раствором NaOH и тщательно перемешали. Из оставшихся 0,5 мл рабочего раствора и 4,5 мл 0,02 М NaOH приготовили контрольный раствор.
Замерили оптическую плотность контрольного раствора (D_контр) и каждой отобранной пробы на спектрофотометре в кюветах 1 см при 400нм против воздуха.

Ход работы:
В ходе эксперимента обнаружилось нехватка раствора фермента. Выданного фермента хватило на три приготовления реакционной смеси из рабочих растворов с концентрациями 0,01 М; 0,005 М; 0,003 М. У коллеги также хватило раствора фермента только на три реакционной смеси, поэтому было принято решение обменяться полученными результатами для более точной дальнейшей обработки результатов.

Полученные результаты:

Обработка результатов:

График зависимости (D-D_контр ) от времени при концентрации рабочего раствора 0,01 М.

График зависимости (D-D_контр ) от времени при концентрации рабочего раствора 0,005 М.

График зависимости (D-D_контр ) от времени при концентрации рабочего раствора 0,003М.

По начальным линейным участкам кинетических кривых вычислили скорости реакций в в 1/мин по следующей схеме: рассчитали для концентрации 0,01 скорости реакций в точках 2 и 5 минут, 5 и 10 минут, так как в этих участках прослеживается линейная зависимость. Далее взяли из четырех значение среднее.

Результаты свели в таблицу.

Далее рассчитали скорости реакций в моль/л*мин, воспользовавшись формулой , 15.2*10³ л/моль*см – молярный коэффициент экстинкции n-нитрофенола при 400 нм, 10 – коэффициент, учитывающий разбавление реакционной смеси 0,02 М раствором NaOH при остановке реакции. Рассчитанные скорости гидролиза n-нитрофенилфосфата, а также обратные им величины свели в таблицу.

Построили график зависимости 1/V от 1/S.

Из графика нашли значения V_{max =} 8,24*10^-6 моль/(л*мин) _,K_m =0,000219 моль/л

Вывод: проанализировав рассчитанные результаты скорости гидролиза n-нитрофенилфосфата при разных концентрациях и найденную по графику максимальную скорость можно сказать, что эксперимент прошел удачно и результаты соответствуют друг другу.
Скорость гидролиза 1 рабочего раствора практически соответствует V_max, показывая, что в ходе эксперимента еще не достигнута максимальная скорость и близкое значение подтверждает достоверность результатов. Причем с уменьшением концентрации рабочего раствора снижается скорость гидролиза, что тоже показывает логичность результатов.

11