Итоговая работа (Практика в Лаборатории биофизических и специальных информационно-измерительных систем), страница 4

2) Функция размытия точки

Функция размытия точки (ФРТ) (или функция импульсного отклика дифракционно-ограниченной системы) определяет распределение интенсивности в фокальной плоскости линзы, обусловленное дифракцией Фраунгофера на входной диафрагме. Точно такое же распределение интенсивности получится от точечного источника в сопряженной плоскости тонкой линзы.

Так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки имеет вид:

(1)

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую ФРТ как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами  , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная ФРТ есть произведение независимых вероятностей (ФРТ осветительной системы и ФРТ системы детектирования). На рисунке 16 приведено изображение обычной ФРТ и конфокальной ФРТ.

Рисунок 16 – Обычная ФРТ (слева) и конфокальная ФРТ (справа)

Из формулы (1) следует, что если , то . Отсюда должно быть понятно, почему разрешающая способность конфокального микроскопа повышается.

3) Контраст

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности, для обычной ФРТ в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0,04%. На рисунке 17 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) невозможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка) данный объект должен хорошо регистрироваться, так как пики хорошо расходятся.

Рисунок 17 – Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок).

Этот факт проиллюстрирован сравнением изображений (рисунок 18), полученных с помощью обычного флуоресцентного микроскопа широкого поля (а, б, в) и конфокального (г, д, е). Как видно из рисунка, конфокальное изображение имеет более высокий контраст.

Рисунок 18 – Сравнение изображений флуоресцентной микроскопии широкого поля (а, б, в) и конфокальной (г, д, е)

4.3 Методика работы с конфокальным микроскопом Veeco VCM-200

На рисунке 19 изображена оптическая система микроскопа Veeco VCM-200.

Рисунок 19 – Оптическая система микроскопа Veeco VCM-200

Одним из способов сканирования в конфокальной микроскопии является использование сканирующего диска – диска Нипкова. Диск Нипкова представляет собой набор точечных диафрагм, расположенных по спирали, таким образом, что за один оборот диска засвечиваются все пиксели матричного фотоприемника и формируется оптический срез. Такая система сканирования называется тандемной. Широкий параллельный пучок от источника белого света (галогеновая лампа) засвечивает участок вращающегося диска с диафрагмами. Этот участок с помощью микрообъектива микроскопа переотображается на исследуемый объект. Отраженное от объекта излучение повторно проходит через диафрагмы и, отражаясь от полупрозрачного зеркала, попадает на приемник. При этом через диафрагмы проходит только та часть излучения, которая отражается от плоскости, оптически сопряженной с плоскостью диска. Глубина фокусировки вдоль оси Z мала, и сигнал дает острый максимум. Записывая сигналы от всех точек фотоприемника при сканировании вдоль Z и затем привязывая координаты максимумов к координатам сканирующей системы, строится профиль поверхности исследуемого объекта. Сканирование вдоль оси Z обеспечивается перемещением микрообъектива.

Основные метрологические и технические характеристики прибора представлены в таблице 7 [5].

На рисунке 20 показан состав микроскопа. Запуск прибора состоит из включения тумблеров:

- микроскопа (расположенного с задней стороны микроскопа и на рисунке не показанного);

- конфокального блока 4;

- осветительного блока 12;

- блока управления предметным столиком 10

и запуска компьютера и программы.

После запуска программы осуществляется инициализация предметного столика с позиционированием в центр.

Фокусировка на объект осуществляется ручкой 15, состоящей из двух коаксиальных ручек для грубой и точной фокусировки. Смена объектива осуществляется кнопками 13, а изменение размера апертурной диафрагмы – кнопками 14. Переключение между камерой 1 и бинокуляром 5 осуществляется ручкой 2.

Таблица 7 – Метрологические и технические характеристики Veeco VCM-200

Рисунок 20 – Описание микроскопа: 1 – видеокамера, 2 – ручка переключения между видеокамерой и бинокуляром, 3 – конфокальный блок, 4 –тумблер конфокального блока, 5 – бинокуляр, 6 – микроскоп Nikon Eclipse L200, 7 – турель с микрообъективами, 8 – предметный столик, 9 – блок управления столиком, 10 – тумблер блока управления столиком , 11 – осветитель, 12 – тумблер осветителя, 13 – кнопки управления сменой объектива, 14 – кнопки управления апертурной диафрагмой, 15 – ручка фокусировки, 16 – джойстик управления предметным столиком, 17 – монитор, 18 – клавиатура, 19 – мышь

На рисунке 21 показаны виды окна программного обеспечения.

Рисунок 21 – Виды окна программного обеспечения: а) – получение изображения поверхности; б) – построение профиля сечения поверхности; в) реконструкция поверхности и построение 3D модели

Процедура выполнения измерений:

1. Включение прибора и запуск программы.

2. Выход на режим источник (5 мин).

3. Калибровка прибора по X, Y и Z (производится однократно).

4. Установка объекта исследования на предметный столик.

5. Фокусировка на объект с нужным объективом при наблюдении в бинокуляр.

6. Позиционирование в нужную зону измерений на объекте с помощью джойстика предметного столика.

7. Повторная фокусировка.

8. Переключение с бинокуляра на камеру.

9. Подстройка экспозиции и усиления камеры с контролем гистограммы изображения.

10. Задание измерительного объема – начальной и конечной точки сканирования по оси Z.

11. Задание шага сканирования по оси Z.

12. Запуск измерений – сканирование и захват изображений.

13. Реконструкция профиля объекта.

14. Обработка измеренных данных:

• графики профилей, вывод сечений;

• 3D изображение;

• расчет высоты;

• шероховатость и пр.

15. Запись на диск результатов измерений.

Назначение микроскопа - измерение профиля поверхности различных отражающих объектов (профилометрия). Микроскоп позволяет измерять как гладкие, так и ступенчатые объекты высотой до 2,5 см и наклоном стенок не более 60 град. Можно измерять и ступеньки с углом наклона более 60 град, однако будут потери данных на границах, которые можно будет интерполировать в программе. Особенностью микроскопа является то, что он позволяет измерять профиль объектов, на которые нанесено прозрачное покрытие. На рисунке 22 представлены измерения различных МЭМС структур (а, б) (микроэлектромеханические системы – технологии и устройства, объединяющие в себе микроэлектронные и микромеханические компоненты; МЭМС устройства обычно изготавливают на кремниевой подложке с помощью технологии микрообработки, аналогично технологии изготовления однокристальных интегральных микросхем) и вытравленная в стекле канавка (в).

Рисунок 22 – Получение профиля поверхностей: а, б – МЭМС структуры; в – вытравленная в стекле канавка

На рисунке 23 представлены двух- и трехмерные изображения лазерного реза, на рисунке 24 – микроканальной пластины, а на рисунке 25 – крыла бабочки. Возможность построения трехмерного изображения значительно расширяет представления о профиле наблюдаемой поверхности.

Более сложные просвечивающие конфокальные микроскопы широко применяются в биологических исследованиях. Они имеют в своем составе различные лазерные источники, наборы сменных светофильтров, спектрометры, дающие возможность возбуждать и регистрировать флуоресценцию объектов на различных длинах волн.

Рисунок 23 – Изображения лазерного реза с увеличением: а) – 5х; б), в) – 50х; г), д) – 100х

Рисунок 24 – Изображения микроканальной пластины с увеличением: а) – 5х; б) – 50х; в), г) – 100х

Рисунок 25 – Изображения крыла бабочки с увеличением: а) – 5х; б) – 10х; в), г) – 20х; д) – 50х