11131 (Кинетика действия ферментов)

Кинетика действия ферментов

Кинетические исследования ферментативных реакций необходимы не только для количественного определения ферментов и сравнения скоростей их функционирования, но, в еще большей степени, для расшифровки механизмов ферментативных реакций. В этих целях, прежде всего, необходимо уметь корректно вычислять кинетические параметры ферментативных реакций, оценивать конкурентный или неконкурентный характер действия ингибиторов. Рассмотрим основные уравнения, описывающие ферментативную кинетику и способы вычислений. Основное внимание будет уделено не строгости математического вывода уравнений, а правильному их использованию для получения достоверных результатов.

При выводе кинетических уравнений количественно характеризующих ферментативную активность, обычно делают следующие допущения.

1. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс за счет сил физической природы. Из этого комплекса в дальнейшем освобождаются фермент и продукт. Таким образом, химической реакцией является только второй этап – распад фермент-субстратного комплекса:

2. Концентрация субстрата обычно значительно выше концентрации фермента. Поэтому при рассмотрении начальных скоростей реакции, когда

3. Константа диссоциации определяется соотношением:

концентрация продукта очень низка, обратимостью второй стадии можно пренебречь. Следовательно, – const., а скорость образования продукта равна:

Поскольку общая концентрация фермента равна сумме концентраций свободного фермента и фермента, связанного в комплекс, то + или = –.

Подставляя значение [Е] = [Е₀] — [ES] из (4), получаем:

С другой стороны, из уравнения следует:

В уравнении выражение к₊₂ можно рассматривать как максимальную скорость, достигаемую, когда концентрация фермент-субстратного комплекса численно равна общей концентрации фермента. Следовательно:

Выражение есть не что иное, как уравнение Михаэлиса–Ментен для ферментативной кинетики, а величина К_га = K_s представляет собой меру сродства фермента к субстрату. Численно она равна такой концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной скорости. Уравнение графически выражается гиперболой.

Для практического определения кинетических параметров этот график неудобен, к тому же требует использования концентраций субстрата, «насыщающих» фермент, что не всегда достижимо при ограниченной растворимости субстрата. Поэтому обычно стремятся преобразовать уравнение Михаэлиса–Ментен в такую форму, чтобы графически оно изображалось прямой линией. Чаще всего для этого используют метод Лайнуивера–Берка, представляя уравнение Михаэлиса–Ментен в виде уравнения прямой линии:

Последнее выражение называют уравнением Лайнуивера–Берка и для расчета кинетических параметров используют график, построенный в координатах: 1/V против 1/S. В результате получается прямая, отсекающая на оси ординат отрезок, равный 1/V, а на продолжении оси абсцисс отрезок, равный – 1/К_га. Однако следует отметить, что при использовании графика Лайнуивера–Берка точки в области высоких концентраций субстрата располагаются слишком густо, а положение прямой линии во многом зависит от точек в области низких концентраций субстрата, где определение скорости менее надежно. Кроме того, реальные экспериментальные данные не всегда адекватно аппроксимируются в виде прямой линии.

Поэтому предложено еще несколько приемов для определения кинетических параметров. Метод Эди–Хофсти также основан на преобразовании уравнения Михаэлиса–Ментен. Умножив обе части уравнения на и преобразовав, получим:

График этого уравнения в координатах V против V/S представляет собой прямую линию, отсекающую на осях ординат и абсцисс отрезки, равные V_maxH V_m>x/ К_го соответственно.

В некоторых случаях для вычисления кинетических параметров удобнее использовать метод Эйзенталя и Корниш–Боуден, основанный на преобразованном уравнении Михаэлиса–Ментен:

В этом случае для каждого значения V и S строится прямая в координатах V и S. Точка пересечения всех этих прямых имеет координаты: V_max и К_т.

Ингибирование ферментов

Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.

При этом, если константа диссоциации комплекса K_s = K_m равна:

Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора. Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования, характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.

При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина К_га не изменяется, а величина V_max снижается.

Возможны также промежуточные или альтернативные случаи, например, когда ингибитор связывается не с ферментом, а с фермент-субстратным комплексом, как в случае бесконкурентного ингибирования, при котором изменяются оба кинетических параметра.

Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера–Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.

При конкурентном ингибировании, если определена величина К_т в присутствии ингибитора, можно рассчитать константу ингибирования по следующей формуле:

При неконкурентном ингибировании с помощью определения измененной величины V можно рассчитать К. по следующей формуле:

Все биохимические процессы в клетке взаимосвязаны и взаимозависимы, тем не менее часть из них преимущественно выполняет функцию построения клеточного материала, а часть – снабжения источниками энергии этих «строительных работ». Поэтому принято разделять биохимические процессы на два основных типа: ассимиляционные, называемые анаболизмом, включающим синтез низкомолекулярных предшественников и построения из них молекул биополимеров, и диссимиляционные, называемые катаболизмом, состоящим в обеспечение источника энергии, «энергетического привода», приводящего в движение анаболизм.

Рассмотрим основные механизмы процессов трансформации энергии в клетке, т.е. механизмы катаболических процессов.

Пути и механизмы преобразования энергии в живых системах

Главная задача энергетического метаболизма – аккумуляция энергии, полученной в результате окислительно-восстановительных превращений субстратов в такую форму, которая может быть использована для роста клеток и осуществления всех их функций.

Основными формами аккумуляции энергии в клетках являются трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов, а также «макроэргические» химические соединения.

В клетках, как и в неживых системах, самопроизвольно протекают только те химические процессы, которые приводят к уменьшению свободной энергии системы, т.е. той доли общей энергии, которая может быть превращена в работу. Такие реакции называют экзэргоническими. Напротив, если ДОО, то реакция не может протекать самопроизвольно, так как требует притока энергии.

Уравнение Гиббса описывает взаимосвязь между свободной энергией, энтальпией и энтропией.

Кратко рассмотрим основные уравнения химической термодинамики.

где ДН – изменение энтальпии; AS – изменение энтропии.

При реакциях в растворах изменение свободной энергии определяется уравнением:

где R – газовая постоянная; Т – абсолютная температура;

– константа равновесия химической реакции.

При стандартных условиях каждая химическая реакция характеризуется свободной энергией, вычисляемой по формуле:

AG° = -2,303 RT lgK или AG = -1,363 lgK_eq ккал/моль^-1 при 25C.

При окислительно-восстановительных реакциях изменение свободной энергии определяется уравнением:

где п – количество перенесенных электронов:

F – число Фарадея: заряд одного моля электронов; Е «' – стандартный окислительно-восстановительный потенциал для окислителя и восстановителя, В.

Эти уравнения удобно применять при расчетах. Например, можно подсчитать, сколько энергии выделяется в результате дыхания;

Таким образом, AG = 2 • 23062 кал • моль^-1 - В-[0,815 - (-0,32)] В = 52351 кал/моль.

Классификация энергетических процессов

Энергетические процессы в нефототрофных организмах подразделяются на аэробные и анаэробные в зависимости от участия или не участия в них молекулярного кислорода.

Аэробное дыхание – энергетический процесс, при котором конечным акцептором электронов окисляемого субстрата, передающихся по электрон-транспортной цепи, является молекулярный кислород.

В анаэробном дыхании конечными акцепторами электронов становятся другие окислители: нитрат-, сульфат-анионы, катионы металлов, органические вещества.

Брожение – энергетический процесс, при котором электроны передаются непосредственно от донора к акцептору без участия электрон-транспортной цепи: гликолиз, молочнокислое брожение и др.

Перечисленные процессы можно классифицировать на основе механизма образования АТР, являющегося основным макроэр-гическим соединением, запасающим энергию в своих химических связях. Различают образование АТР в результате переноса электронов по дыхательной цепи – окислительное фосфорилирование, а также образование АТР в процессах, не связанных с переносом электронов по цепи – субстратное фосфорилирование. В настоящее время первый тип процессов правильнее называть образованием АТР за счет трансформации энергии трансмембранного электрохимического потенциала или сокращенно – мембранным фос-форилированием.

У фототрофных организмов основным способом запасания энергии является фо-тофосфорилирование, т.е. образование АТР за счет трансформации энергии ТЭП, формируемого путем утилизации световой энергии.