166697 (Методики анализа витаминов)

Методики анализа витаминов

Витамин А

(Мол. вес 299,22)

Являясь сильно ненасыщенным соединением, витамин А легко реагирует с кислородом воздуха и окисляющими агентами.

Наличие в молекуле спиртовой группы обусловливает реакции с хлорангидридами кислот с образованием производных — бензоат, ацетат и др. в-нафтойнокислый эфир представляет кристаллическое вещество, также обладающее витаминным действием.

Качественные реакции

1. Максимум абсорбции при 328 нм.

2. В хлороформном растворе с треххлористой сурьмой появляется синее окрашивание.

Количественное определение

Реакция с треххлористой сурьмой используется и для количественного определения. Синюю окраску сравнивают со стандартной шкалой так называемых синих единиц.

5—10 г драже экстрагируют хлороформом для извлечения витамина А, хлороформ отгоняют. Остаток омыляют 0,5 н. раствором спиртового раствора едкого кали в продолжение ½ часа. После этого из смеси извлекают неомыляемую фракцию серным эфиром 3—4 порциями (по 50—100 мл), соединенные эфирные вытяжки промывают водой, высушивают безводным сульфатом натрия, растворитель нацело удаляют выпариванием в токе углекислоты, остаток растворяют в хлороформе, чтобы в 1 мл раствора содержалось от 10 до 40 ИЕ витамина А.

К 0,2 мл хлороформного раствора добавляют 1 каплю уксусного ангидрида и 2 мл хлороформного раствора треххлористой сурьмы. Появляющуюся синюю окраску немедленно сравнивают с подходящей по цветности пробиркой стандартной шкалы или в ступенчатом фотометре, фотоколориметре и т. д.

При визуальном способе определения наиболее точные результаты получаются, если окраска по интенсивности укладывается в пределах 4—10-й пробирок.

Для приготовления шкалы пробирок-эталонов 75 г химически чистого сульфата меди и 3,5 г химически чистого нитрата кобальта растворяют в 500 мл воды. Полученный раствор разбавляют водой, как указано ниже.

Реакция витамина А с треххлористой сурьмой протекает быстро, достигая максимума приблизительно через 10 секунд; при низких температурах (0—1°) окраска более устойчива; яркий (дневной или искусственный) свет заметно влияет на быстроту выцветаемости.

Витамин В1 (Тиамин-бромид бромистоводородный)

(Мол. вес 435,2)

1. Качественные реакции. При прибавлении к подкисленному разведенной азотной кислотой 1%-ному раствору нескольких капель раствора нитрата серебра выпадает творожистый осадок, не растворимый в азотной кислоте.

2. Тиохромная проба основана на переводе тиамина красной кровяной солью в щелочной среде в тиохром, растворимый в бутиловом или изоамиловом спирте с синей флуоресценцией:

К 5 мл раствора тиамина (с содержанием 0,01 мг) в делительной воронке добавляют 5 мл 1%-ного раствора красной кровяной соли, перемешивают и оставляют стоять в течение 2 минут. Затем добавляют 20 мл изобутилового спирта и сильно перемешивают, встряхивая в течение 1 минуты, отделяют спиртовый слой и фильтруют. Тиохром, полученный в результате окисления тиамина, обусловливает синюю флуоресценцию.

1. Тиамин дает осадки с некоторыми общими алкалоидными реактивами, например с реактивом Драгендорфа (пикриновая кислота не дает осадка).

Количественное определение

1. После нейтрализации (по бромтимоловому синему) тиамин-бромид определяется аргентометрически.

2. Другой метод основан на свойстве витамина В1 образовывать с диазотированным пара-амино-ацетофеноном соединение фиолетово-красного цвета, которое нерастворимо в воде, со многими органическими растворителями образует цветные растворы, допускающие сравнение с эталонными растворами. Из органических растворителей применяют обычно ксилол или толуол.

Для определения тиамина, растворенного в однородном бесцветном растворителе, нет необходимости извлекать цветное соединение из раствора. В этих случаях прибавляют изопропанол в количестве, достаточном для растворения цветного соединения, и проводят определение по стандартному раствору.

Для анализа берут такое количество препарата, в котором содержится 100 микрограммов (0,0001 г) тиамина. Эталон готовят растворением 50 мг витамина Вх (точная навеска) в 500 мл 50% по объему) этанола, содержащего 1 каплю 4 н. соляной кислоты. Хотя этот эталонный раствор можно сохранять при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, предпочитают все же готовить его на срок не более 1 месяца. Кроме эталонного раствора заготовляют: 1) 0,03%-ного раствора пара-амино-ацетофенона в 0,2 н. соляной кислоте; 2) 0,1%-ный раствор нитрита натрия; 3) 1 н. и 2,5 н. растворы едкого натра; 4) 50%-ный этанол (по объему); 5) толуол; 6) изопропанол и 7) 4 н. соляную кислоту.

Для приготовления реактива под названием диазораствор А в небольшой склянке смешивают 10 мл раствора пара-амино-ацетофенона и 2 мл раствора нитрита натрия и охлаждают не менее 2 минут в ледяной воде. Перед пользованием к смеси прибавляют 3 мл 1 н. раствора едкого натра и взбалтывают. Реактив под названием диазораствор Б готовят так же, как и раствор А, с той лишь разницей, что вместо 1 н. раствора едкого натра к раствору Б прибавляют 2,5 н. раствора едкого натра.

Испытуемый ампульный раствор смешивают с таким количеством перегнанной воды, чтобы каждый миллилитр смеси содержал около 100 микрограммов тиамина. В калиброванную пробирку на 10 мл вливают 1 мл смеси, прибавляют 2 мл 50%-ного этанола и помещают в водяную баню при температуре 60°. Через 1 минуту приливают 1 мл диазораствора А, сильно взбалтывают и снова оставляют в бане на 2—-3 минуты. Затем смесь охлаждают, прибавляют 1 каплю 4 н. соляной кислоты и изопропанол до метки, взбалтывают и сравнивают в колориметре с контрольным раствором, изготовляемым смешением 1 мл воды с 1 мл эталонного раствора тиамина, 1 мл 50% этанола и 1 мл диазораствора А по методу, описанному выше.

1. Для определения витамин В1 по другому методу растворяют 0,4—1,5 мг его в 10 мл воды, прибавляют 0,5 мл реактива с фосфорно-вольфраматом и 0,4—0,6 мл 10%-ного раствора едкого натра. Появляется синее окрашивание. Титруют 0,002 н. раствором красной кровяной соли, 1,82 мл которого соответствует 1 мг витамина В^ до исчезновения синего окрашивания.

Реактив готовят следующим образом: 10 г вольфрамата натрия растворяют в 75 мл воды, прибавляют 8 мл 85%-ной фосфорной кислоты и слабо нагревают в течение 2 часов. Если раствор зеленеет, прибавляют немного бромной воды после нагревания в течение указанного времени и избыток брома удаляют кипячением. По охлаждении доводят до 100 мл.

Витамин В2 (Рибофлавин. Лактофлавин)

(Мол. вес 376,2)

Качественные реакции

1. 0,001%-ный раствор (1 мг: 100) рибофлавина — бледного зеленовато-желтого цвета в проходящем свете с интенсивной желтовато-зеленой флуоресценцией, исчезающей от прибавления минеральных кислот или щелочей.

2. При восстановлении цинком в уксуснокислом или солянокислом растворе рибофлавин переходит в лейкофлавин, присоединяя 2 атома водорода.

Количественное определение

1. Непосредственно колориметрированием желтых растворов рибофлавина.

2. По азоту. К 0,3 г рибофлавина (точная навеска), предварительно высушенного в течение 18 часов в вакуум-эксикаторе над серной кислотой, в кьельдалевской колбе прибавляют 1 г бензойной кислоты и определяют содержание азота, разрушая смесь не менее 5 часов. Содержание азота должно быть не менее 14,5% и не более 15,2%.

Витамин В6 (Пиридоксин. Адермин)

(Мол. вес 205,6)

Качественные реакции

1. С фосфорно-вольфрамовой кислотой адермин образует нерастворимое соединение (осадок).

2. С хлорным железом адермин дает красное окрашивание.

3. Смешивают 1 мл 0,01%-ного раствора с 1 мл 0,04%-ного раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида в абсолютном алкоголе и затем прибавляют 1 каплю раствора аммиака — появляется синее окрашивание.

Количественное определение

1. Колориметрическое определение основано на превращении четвертичного основания в фиолетового цвета соединение типа кар-бопиридинцианина, которое колориметрируют, сравнивая со стандартом.

2. Солянокислую соль адермина можно определять титрованием раствором щелочи при индикаторе бромтимоловом синем; для проверки оттитрованную жидкость вновь титруют 0,1 н. раствором нитрата серебра.

Фолиевая кислота (Птероилглутаминовая кислота)

(Мол. вес 441,21)

Качественные реакции

1. Получение азокрасителя.

2. Спектр поглощения в ультрафиолете (при рН 11) имеет максимум при 255, 282 и 365 нм.

Количественное определение

При восстановлении фолиевой кислоты в солянокислом растворе цинковой пылью в числе других продуктов отщепляется пара-амино-бензойная кислота, которую диазотируют нитритом натрия. Полученная соль диазония сочетается с N-(1-нафтил)-этилендиаминди-гидрохлоридом в присутствии сульфамата аммония NH2SO2 ONH4

При этом наблюдается фиолетовая окраска раствора, интенсивность которой пропорциональна концентрации и измеряется в фотоколориметре или в спектрофотометре.

Требуются реактивы: 1) раствор желатины (1,5 г желатины и 0,1 г бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды), 2) 10%-ный раствор соляной кислоты, 3) 0,1%-ный раствор нитрита натрия, 4) 8%-ный раствор мочевины и 5) 0,1%-ный раствор N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида.

Точно 0,05 г пара-аминобензойной кислоты с температурой плавления 186—187° отвешивают в стаканчике емкостью 15—20 мл, растворяют в 96%-ном этиловом спирте, переливают в мерную колбу емкостью 50 мл, стаканчик промывают 3—4 раза спиртом (общее количество спирта 25 мл), раствор доводят водой до метки и перемешивают. Из этого раствора отбирают 1 мл в колбу емкостью 250 мл, прибавляют 175 мл воды, 45 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, 2,5 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают. В 1 мл раствора содержится 0,004 мг пара-аминобензойной кислоты.

В четыре колбы емкостью 15—20 мл вливают пипеткой 1, 2, 3 и 4 мл приготовленного раствора и доводят объем раствора в каждой колбе водой до 5 мл и прибавляют по 0,7 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, по 1 мл 0,1%-ного раствора нитрита натрия, хорошо перемешивают и оставляют на 5 минут. Затем в каждую колбу прибавляют по 1 мл 8%-ного раствора мочевины, перемешивают и вновь оставляют на 5 минут. После этого в каждую колбу прибавляют по 1 мл 0,1%-ного раствора N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида, по 1,3 мл воды, перемешивают, оставляют на 10 минут и затем определяют окраски раствора" электрофотоколориметром со светофильтром 550 нм. Для получения стандартной кривой на оси ординат наносят показания гальванометра, а на оси абсцисс — количество миллиграммов и соединяют прямой линией точки пересечения перпендикуляров, восстановленных из соответствующих точек осей графика.

Определение общего количества (связанной и свободной) р-аминобензоилглутаминовой кислоты в препаратах

Точную навеску препарата (0,049—0,050 г) в стаканчике емкостью 15—20 мл смачивают несколькими каплями воды и растворяют в 0,1 н. растворе едкого натра. Раствор переливают в мерную колбу емкостью 50 мл, стаканчик промывают несколько раз 0,1 н. раствором едкого натра, сливая промывную жидкость в ту же колбу. Объем раствора доводят 0,1 н. раствором едкого натра до метки и хорошо перемешивают. Из полученного раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 75 мл воды, 18 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, 1 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают (раствор А).

К 75 мл раствора в конической колбе емкостью 150 мл прибавляют 0,5 г цинковой пыли и оставляют на 15 минут при частом перемешивании. Раствор фильтруют через сухой фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 15—20 мл фильтрата. К 2 мл фильтрата в колбе емкостью 15—20 мл прибавляют 3 мл воды, 0,7 мл 10%-ного раствора соляной кислоты и далее поступают, как указано при получении стандартной кривой.

Определение свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоты

К 2 мл раствора А в колбе емкостью 15—20 мл добавляют 8 мл воды и далее поступают, как описано при определении общего количества пара-аминобензоилглутаминовой кислоты. Содержание фолиевой кислоты в граммах (х) вычисляют по формуле

где а — общее количество свободной и связанной пара-аминобензоилглутаминовой кислоты, найденной по калибровочной кривой, в миллиграммах; b — количество свободной пара-аминобензоилглутаминовой кислоты, найденной по калибровочной кривой, в миллиграммах; 25 и 10 — постоянные коэффициенты; 3,22 — фактор пересчета пара-аминобензоилглутаминовой кислоты на фолиевую кислоту.

Витамин В12 (Цианкобаламин)

Качественные реакции