referat_for_bank (Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение), страница 2

Эти структуры были подтвержденны методом двумерного ЯМР [18], и показали что грамицидин в этаноле так же существует в виде 4-х взаимопревращаемых конформаций . Виды 1 и 2 являются левозакрученными параллельными двойными спиралями с 5,6 аминокислотного остатка на виток. Они отличаются взаимным расположением цепей и имеют одинаковый шаг спирали и высоту. Вид 2 имеет менее упорядоченные концы спирали обусловленные сдвигом на три аминокислотных остатка [17].

Вид 4 представляет из себя правозакрученной параллельной двойной спиралью, с таким же взаимным расположением цепей и высотой спирали что и вид 1 (это обуславливает форму его спектра КД, являющуюся зеркальным отображением видов 1 и 2).

Вид 3 (форма, образующаяся сразу после растворения кристаллов грамицидина) является левозакрученной антипараллельной двойной спиральюс 5,6 остатка на виток и сдвигом на три аминокислотных остатка. Эта форма является наиболее термодинамически выгодной в кристаллическом состоянии (рис.2) [19].

Рисунок 2. СРК Изображение левозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина с 5,6 остатка на виток (PDB Code: 1ALX). А – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами. Водороды скрыты.

Все описанные спирали стабилизирются 28-ю межмолекулярными водородными связями, не имеют внутримолекулярных водородных связей и совпадают с модельными , предложенными Витчом и сотр [10].

Грамицидин образует такую же смесь конформаций в различных спиртах, этилацетате [6] , и, хотя, время взаимоперехода в этих растворителях меньше

[20] , множественность структур все же удается зарегестрировать методом ЯМР [18].

Исследования грамицидина в растворе DMSO показали, что он находится в виде мономера, и обнаруживается в виде одного пятна на тонкослойной пластинке [16] . Методом ЯМР было показано, что в DMSO грамицидин находится в быстром равновесии между неупорядоченной конформацией и различными спиралями, имеющими другую форму, чем описанные выше [21].

В трифторэтаноле грамицидин представляет собой мономер [22] , а форма спектра КД больше похожа на спектр грамицидина в мембране [23] , и, таким образом, представляет из себя еще один вид трехмерной структуры грамицидина.

Таким образом, грамицидин существует в различных конформациях, в зависимости от растворителя, и даже в виде набора нескольких конформаций в одном растворителе. Такой полиморфизм можно объяснить похожими энергиями стабилизации различных структур, обусловленных различной сетью водородных связей.

2.4.Структура грамицидина в липидных мембранах и мембрано-подобных средах

Спектр КД встроенного в липидный бислой грамицидина не похож ни на один спектр, полученный в различных органических растворителях [24]. Более того данный спектр нельзя представить как сумму какой либо комбинации спектров растворов грамицидина, и, следовательно, как комбинацию каких-то конформаций обнаруженных в растворах. Форма КД спектра мембрансвязанного грамицидина остается неизменной в широком диапазоне температур. С другой стороны, основываясь на данных только спектров КД нельзя сказать, существует ли грамицидин в какой-то одной форме, или же имеется набор конформеров.

Изученные методом ЯМР ¹³С и ¹⁹F меченые грамицидины, встроенные в липосомы [25-27] , показали существование одной доминирующей структуры в мембранах.

Спектр КД мембрансвязанного грамицидина в области дальнего ультрафиолета имеет форму похожую на экситонное расщепление, свидетельствующую о стэкинг взаимодействиях триптофанов в данном окружении [28]. Экситонное расщепление так же наблюдается в области ближнего ультрафиолета [18] . что свидетельствует о внутримолекулярных взаимодействиях (Такого экситонного расщепления не наблюдается в растворах, что является еще одним подтверждением разности конформаций в мембране и в растворе). Другие методы [29, 30] так же подтверждают наличе стэкинг вззаимодействий в мембрансвязанной форме. Данные результаты свидетельствуют о различии в конформации как полипептидного остова, так и в ориентации боковых цепей между мембрансвязанной конформацией и формами, существующими в растворах.

Синхронные исследования флуресценции и проводимости в черных липидных мембранах [31] и в липосомах [32] показывают, что проводящая форма грамицидина является димером. В исследованиях с одиночными каналами (при соотношении грамицидин/липид около 1:10000), регистрация открывания и закрывания канала соотносится с равновесием мономер-димер (Рис.3)

Грамицидин так же образует комплексы с такиими детергентами как лизолецитин [33] , и додецилсульфат натрия [34]. Исследования таких комплексом методом электронной микроскопии (метод замораживания-скалывания) свидетельствуют о наличии мультиламелярной фазы детергента, в то время как с другими белками и пептидами эти детергенты формируют типичную мицелярную фазу , более того данные ¹⁵Р и ²Н ЯМР, а так же дифракции ренгеновских лучей при малом угле демонстрируют, что амфифильные группы молекул детергента имеют бислой-подобную организацию. Этот пример – хорошая демонстрация влияния грамицидина на организацию окружающих его молекул липида [35]

Так как детергент в комплексе с грамицидином оразует мембраноподобные структуры, можно предположить, что трехмерная структура грамицидина в данной системе такая же, как и в бислойных мембранах, хотя другие небольшие пептиды часто имеют различную структуру в мицеллах и в липидных бислоях.

Мембрансвязанная форма грамицидина представляет собой спиральный димер, что было подтвержденно различными химическими и физическими методами. Данные ЯМР-спектроскопии с использованием ¹³С и ¹⁹F меченных грамицидинов встроенных в липосомы показали наличие структуры в которой N-конец молекулы расположен посередине бислоя , а С-конец ориентирован наружу [25, 26, 27 ]. ЯМР в твердом теле (ориентированные мультиламелярные бислои ) обнаружил такую же структуру [36]. Изучение проводимости аналогов грамицидина в черных липидных мембранах покзали что модифицированные по С-концу аналоги способны образовывать активные каналы только при добавлении их с двух сторон мембраны и не образуют их при добавлении с одной стороны мембраны. Так как заряженные молекулы не могут переходить с одной стороны мембраны на другую – это явилось еще одним подтверждением того, что мембрансвязанная форма является спиральным димером N-конец к N-концу

В спиральном димере N-конец к N-концу каждый мономер стабилизирован 12-ю внутимолекулярными водородными связями, а димер – 6-ю межмолекулярными водородными связями, в образованиии которых принимают участие N-концевые формильные группы. Предложенно, что открывание и закрывание канала связанно с ассоциацией и диссоциацией ( то есть с образованием и разрывом межмолекулярных водородных связей) такого ддимера [37] (РИС).

Рисунок 3.

Схематическое изображение инактивации грамицидинового канала путем диссоциации димера голова к голове (структура Урри – Арсеньева).

Изучения аналогов грамицидина показали, что N-коцевая формильная группа оказывает сильное влияние на стабильность димера [38]. При ее замещении на более объемную ацетильную [39], сукцинильную [40] или при отсутствии вообще время жизни канала уменьшается. Исследования методом КД-спектроскопии показали сильные конформационные различия между нативным грамицидином и его аналогами, что, возможно является причиной дестабилизации канала [41].

Дальнейшие исследования с помощью 13С- и 15N-меченных аналогов в ориентированных мультиламелярных бислоях показали возможность существования праозакрученной конформации канала [24].

Наиболее детальная структурная конформация грамицидина была определенна методом двумерного ЯМР в комплексе грамицидина с додецилсульфатом натрия (Арсеньев и сотр. 1985 г.). Данная структура представляет собой спиральный димер, в котором каждая составляющая спираль имеет 6,3 остатка на виток (^6,3-спиральный димер) (Рис.4.)

А Б

Рисунок 4.

СРК Изображение правозакрученного спирального димера грамицидина с 6,3 остатка на виток (PDB Code: 1GRM). A – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами. Водороды скрыты.

. Дальнейшие исследования показали что одна пара остатков Trp (⁹Trp и ¹⁵Trp ) могут находиться в стэкинг взаимодействиях [41]. Более того, теоретические расчеты показали, что наиболее энергетически выгодной структурой в мембране является именно ^6,3-спиральный димер, в котором остатки триптофана образуют кластеры на границе раздела фазы липид-вода, и их азоты индoльных групп способны взаимодействовать с полярными головками липидов и с молекулами воды. В двухспиральной конформации остатки триптофана расположенны равномерно по внеешней поверхности спирали и только два из них (в отличие от четырех в ^6,3спиральном димере) могут взаимодействовать с молекулами липидов или водой. Таким образом, двухспиральная конформация энергетически дестабилизиированна в мембране по отношению к спиральному димеру [41] (рис.5).

А Б В

Рисунок 5 Положение боковых радикалов остатков триптофана в различных конформерах грамицидина. Вид сбоку.

Боковые радикалы триптофанов выделенны синим цветом. А – β^6,3-спиральный димер (Структура Урри-Арсеньева, наблюдаемая в мембранах); Б – ββ^5,6-двухспиральный димер (Структура Витча, наблюдаемая в органических растворителях); С – β7,2-двухспиральный димер (структура комплекса грамицидина с ионом цезия в органических растворителях и кристаллах)

Спектроскопические исследования грамицидина в различных мембранах показали, что соотношение спиральных и двухспиральных димеров является функцией степени ненасыщенности липидов, образующих мембрану. При увеличении доли ненасыщенных липидов увеличивается доля двухспиральной конформации. Эти результаты говорят о том, что боковые цепи триптофанов могут взаимодействовать с С=С связями [42]. Модельные исследования в кобинации с экспериметами по изучению липид – пептидных взаимодействий так же подтверждают важность этих аминокислот для стабилизации канальной структуры и оказывают влияние на организацию окружающих грамицидин липидов [ 17]

В результате (в 90% случаев) грамицидин образуе активный трансмембранный канал одной единственной структуры, являющейся ^6,3-спиральным димером. Эта структура аналогична модели предложенной ранее Урри [12].

2.5.Влияние связывания ионов на конформацию грамицидина

Грамицидин способен транспортировать одновалентные катионы через фосфолипидные мембраны [43].Его разная селективность по отношению к различным представителям группы щелочных металов определяется как размером конкретного иона, так и значением его энергии гидратации. Относительные константы афинности с натрием, калием, рубидием, цезием и талием были исследованны с помощью метода регистрации одиночных каналов [44], изучения аналогов грамицидина [45],равновесного диализа [46], ЯМР [47], проводимости воды [48] и показали, что константа связывания талия на порядок меньше чем цезия и на два порядка меньше чем натрия. Дальнейшие исследования показали, что с каналом одновременно могут связываться два иона, причем константа связывания первого катиона больше чем второго [49], что видимо, связано с электростатическим отталкиванием.

Двухвалентные катионы блокируют проведение одновалентных [39] и нетранспортируются грамицидиновым каналом. Последние исследования [49] показали, что частично дегидратированный двухвалентный катион связыватся с грамицидином с большей энтальпией чем одновалентный. Таоке сильное взаимодействие является следствием низкой подвижности двухвалентных катионов в грамицидиновом канале.

Связывание анионов с грамицидиновым каналом не было продемонстрированно, хотя существуют некоторые доказательства их проводимости и влияния на транспорт катионов [44].

Взаимодеиствие грамицидина с одновалентными катионами оказывает слабое влияние (или вовсе не влияет) на форму его спектра КД [50], и, таким образом, на конформацию грамицидина.

Комплексы грамицидина с лизолецитином так же связывают катионы, они были использованны для определения констант связывания [51] и локализации сайтов связывания. В данной системе наблюдается изменение формы спектра КД при связывании катионов (в отличие от комплекса с додецилсульфатом натрия, где такой эффект отсутствует), что свидетельствует об изменении конформации при таком взаимодействии [52].

В органических растворителях наблюдается сильное изменение структуры грамицидина при связывании с катионом , что демонстрируется изменением как формы, так и амплитуды спектра КД.

При исследовании связывания цезия с грамицидином в растворе наблюдается постепенное изменение формы спектра КД, что свидетельствет о плавном переходе из формы свободного грамицидина в ион-связанною. Эти данные были использованны для определения констант связывания цезия, которые составили К₁=170 М^-1 – для первого (более крепкого )сайта, и К₂=20 М^-1 – для второго (более слабого ) сайта связывания. Константа связывания для лития, определенная тем же методом имеет величину на порядок меньшую, чем таковая для цезия [28]. Константа связывания для натрия была определенны методом ²³Na ЯМР [53] и составила 4 М^-1. Константы связывания других ионов не были определенны, в связи с их низкой аффинностью, что делает такие изимерения довольно сложными.

В растворе хлороформ-метанол в присутствии тиоцианата цезия грамицидин (по данным двумерной ЯМР-спектроскопии) представляет собой правозакрученную антипараллельную двойную спираль с 7,2 остатка на виток (^7,2-спиральный димер) и сдвигом в 1,5 остатка, что свидетельствует о том, что ¹Val не участвует в образовании водородных связей [54] (рис.6). Кристаллические структуры грамицидина дают дополнительную информацию о его трехмерной структуре и, более того, возможность формирования кристаллов в отсутствии и в присутствии ионов позволяют изучить их влияние. Обе ионсвязанная и ионсвободная кристаллические структуры грамицидина являются левозакрученными антипараллельными двойными спиралями и отличаются от форм в растворе значениями углов  и , направлением образования водородных связей и регулярностью укладки полипептидного остова. Ионсвободная кристаллическая форма длиннее (31 Ǻ) и уже (внутренняя полость довольно узкая и в некоторых местах не способна связывать ион) чем кристаллическая форма с тиоцианатом цезия (26 Ǻ в длину , 4,9 Ǻ – внутренний диаметр поры, в которой помещается ион цезия) [17].