Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

А Б

.Рисунок 6.

СРК Изображение правозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина с 7,2 остатка на виток (ββ^7,2 -двухспиральный димер) (PDB Code: 1AV2) в компелексе с цезием. А – вид сверху и ион цезия; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами (красный и синий).

Конформация полипептидного остова в ион-связанной форме грамицидина более упорядоченна, хотя и имеются некоторые вариации углов  и  в районах прилегающих к сайтам связывания катионов, а водородные связи направленны почти параллельно оси спрали [55]. Это говорит о том что данная спираль с большей вероятностью имее 6,4 остатка на виток, чем 7,2 .

Сравнение ион-свободных и ион-связанных форм грамицидина показало, что при связывании происходит переупаковка и адаптация трехмерной структуры под конкретный катион. Такая перестройка возможна при реорганизации водородных связей. Так же наблюдается локальное расширение спирали в местах связывания иона и реориентация карбонильных групп пептидного остова, участвующих в связывании ионов [17].

2.6.Локализация сайтов связывания катионов в различных конформациях грамицидина

Катион связывающие сайты в двухцепочечных структурах могут быть определенны непосредственно из их кристаллических структур в комплексе с хлоридом цезия [56]. Внутри поры находятся два иона цезия симметрично расположенных на растоянии ~7,2 Ǻ от конца спирали. Сайты связывания сформированны карбонильными группами полипептидного остова, которые, связывая ион ориентируются к оси спирали под углом ~40º. Угловое перераспределение карбонильных групп увеличивает дистанции между группами, образующими водородные связи, и таким образом изменяются значения углов  и ψ. Карбонильные группы на противоположных сторонах поры, пренадлежащие остаткам ¹¹Trp и ¹⁴Leu, являются ближайшими к связанному катиону. В таких кристаллах помимо двух ионов цезия в комплексе с грамицидином так же находятся еще и три иона хлора, два из которых расположенны на противоположных концах спирали, а третий - в её центральной части. Ионы хлора отделены от цезия молекулами растворителя на растояние ~10 Ǻ. Наличие связанных ионов хлора довольно необычно, так как грамицидин не транспортирует анионы, а теоретические расчеты [57] показывают, что энергетический барьер связывания аниона значительно больше чем катиона (что делает вход в канал для аниона менее выгодным). Присутствие аниона внутри поры может быть вызвано высокой концентрацией соли в кристаллах и ионы хлора взаимодействуют с сайтами связывания подобно тому как это делают молекулы растворителя. В кристаллах с тиоцианатом цезия позиция иона цезия отличается от таковой в кристаллах с хлоридом цезия [55]. Исследования показали, что в этих кристаллах сайты связывания находятся ближе к концам спирали.

Наблюдение различных сайтов связывания катионов в кристаллах могут моделировать отдельные стадии транспорта катиона через грамицидиновый канал.

Потенциальные взаимодействия катионов с грамицидиновым каналом были изученны с помощью расчетов теоретических энергий и молекулярно-динамических симуляций [58], и показали важность С-концевой этаноламиновой группы для энергетического профиля канала, а точенее, для локализации энергетического минимума и динамики колебаний карбонильных групп полипептидного остова и трансмембранного транспорта катионов [59].

Замещение С-концевой этаноламиновой группы не влияет на свойства проводимости, она возможно играет роль в стабилизации некоторых конформаций грамицидиновой молекулы. При входе в канал катион постепенно обменивает свою гидратную оболочку на карбонильные группы полипептидного остова грамицидина, этаноламин (а точнее его гидроксильная группа) играет роль своеобразного посредника при таком переходе и забирает часть молекул воды гидратированного иона на себя, облегчая таким образом его вход в канал. [60].

Энергетические профили спирального и двухспирального димеров отличаются не очень сильно, за исключением величины энергетического барьера при входе в канал, и за счет этого двухспиральные каналы могут иметь меньшую проводимость чем односпиральные [17].

2.7.Взаимоотношения между конформационными состояниями грамицидина и проводящими формами

Грамицидин формирует характерные каналы при исследованиях в черных липидных мембранах. Проводимость одиночных каналов и их время жизни зависит не только от природы липида, формирующего бислой, но и от присутствующих в среде ионов. Проводимость и среднее время жизни грамицидновых каналов находятся в довольно узком диапазоне. В мембранах сформированных из глицерол-моноолеата [43] или из дифитаноилфосфатидилхолина [61] в присутствии 0,1 М NaCl средняя проводимость равна ~5 пикосименс (pS), а время жизни - ~0,5 секунд. При более высоких концентрациях соли проводимость увеличивается, а в более толстых мембранах, полученных при использовании различных растворителей, время жизни канала уменьшается при неизменной проводимости [43]. Симметрия расчитанного энергетического профиля говорит о том, что основная проводящая форма канала представляет собой структуру с центральной симметрией. Соотнося эти данные с остальными результатами можно сказать что основной проводящей структурой является спиральный димер N-конец к N-концу , хотя и нельзя полностью отрицать возможность существования активного канала антипараллельной двухцепочечной спиральной структуры, что было подтвержденно экспериментально [17]. В некоторых экспериментах при различных пропорциях липидов, используемых для формирования бислоя были обнаруженны очень долгоживущие каналы ( время жизни >100 сек.), которые были представленны в соотношении 5-10% по отношению к основной форме. Гибридные аналоги грамицидина, не способные формировать димер N-конец к N-концу, но способные образовывать двойные спирали так же обнаруживали такие же долго живущие каналы [32]. Более того кросс-сшитые аналоги (С-конец к N-концу), так же не способные образовывать димер N-конец к N-концу образовывали долгоживущие каналы в соотношении 80% к основной форме [62].

Помимо основной и долгоживущей форм каналов были обнаруженны еще и “мини” каналы сменьшей средней проводимостью и временем жизни, формирующиеся в различных пропорциях по отношению к основной форме в зависимости от условий образования бислоя [63,64]. Данные каналы предположительно имеют такую же структуру что и основная форма (спиральный димер N-конец к N-концу), но отличаются от нее другой ориентацией карбонильных групп полипептидного остова в сайтах связывания катионов [65].

Изучения синтетических аналогов грамицидина помогают определить молекулярную основу свойств природного грамицидинового канала. Одним из важных наблюдений является корреляция свойств специфической структуры с функцией. Хорошим примером такой корреляции является возможность образования гибридных каналов [66], представляющих собой димеры в которых один мономер представлен каким-либо аналогом, а второй – другим аналогом или же нативным грамицидином.

Одна доминирующая проводящая форма существует в бислоиных мембранах, которая является спиральным димером N-конец к N-концу (голова к голове). Кроме того существуют другие проводящие формы, найденные в различных пропорциях в зависимости от условий эксперимента. Некоторые из них возможно имеют конформацию двойной спирали.

2.8.Встраивание в мембрану и стабильность

В исследованиях по проводимости грамицидин может быть добавлен к сформированной мембране в качестве концентрированного спиртового раствора. При встраивании в липосомы грамицидин может быть добавленн таким же образом ( то есть добавление концентрированного спиртового раствора к приготовленным липосомам) [33] или же совместным растворением с липидом перед формированием липосом [26]. Переход грамицидина в активную проводящую форму обычно сопроваждается нагреванием или озвучиванием [67].

Легкость всраивания грамицидина зависит от типа используемого липида и от соотношения липид/грамицидин [23]. В общем липиды с более выской температурой фазового перехода должны нагреваться более сильно для лучшего встраиваия грамицидина. Более того, в образцах, где приходится более 20 молекул липида на молекулу грамицидина нагревания до 30°С достаточно для встраивания грамицидина, а образци имеющие менее 10 молекул липида на молекулу грамицидина необходимо нагревать до 65°С в течение 48 часов для такого же встраивания [17].

Некоторые исследования показывают, что при низких соотношениях грамицидин/липид легкость встраивания зависит от того в каком растворителе до этого находился грамицидин (так называемая история растворения) [68]. Если липид-грамицидиновый комплекс перед образованием липосом был растворен в трифторэтаноле активный канал образуется немедленно вместе с формированием бислоя , если же использовался раствор в смеси хлороформ-метанол, то для встраивания необходимо сильное нагревание. Такая зависимомть исчезает при более высоких соотношениях грамицидин-липид, и не наблюдается никакого эффекта по свойствам проводимости. Это говорит о том, что взаимодействия с липидом играют важную роль в стабилизации активной проводящей структуры а фазовое состояние важно для процесса встраивания . Также природа комплексов грамициди-липид была изученна с помощью метода ЯМР [69], которые показали, что при низком соотношении грамицидин – липид липид образует гексагональную фазу, а не бислой. Это так же может быть причиной трудности встраивания грамицидина в данных условиях. С помощью спектров КД был охарактеризован процесс встраивания грамицидина в липид: до начала встраивания в предварительно приготовленные липосомы, грамицидин присутствует в виде двойной спирали в присутствии ионов [67]. При нагревании грамицидин переходит в одиночную спираль и встраивается в бислой. В промежуточные времена этого процесса спектр представляет собой линейную комбинацию спектров этих двух структур. Такие же процессы наблюдаются и в отсутствии иона. Одна из точек зрения на этот процесс заключается в том, что расплетание двойной спирали происходит до тех пор, пока N- конец c другим N-концом и такая структура будет почти эквивалентна спиральному димеру [17]. Такой процесс требует разрыва всех 28 водородных связей и является очень энергоемким, а затем снова их образования. Разница энергий между двух- и односпиральной конформациями не очень велика, так как они имеют почти одинаковое количество водородных связей. В общем, можно сказать, что детали данного процесса до конца не ясны.

Возможно двухспиральная конформация имеет некоторую стабильность в бислое, но когда грамицидин становится ориентирован таким образом, что способен сформировать одиночную спираль, эта конформация становится предпочтительной, и, таким образом можно предположить, что спиральная конформация явлвется результатом специфического взаимодействия и ориентации грамицидина и липида. Теоретические [70] и экспериметальные [71] данные исследований с использованием липидов, в которых кислород карбонильной группы замещен на водород ( имитируя таким образом простую эфирную связь) показали, что одиночная спираль грамицидина дестабилизированна в этих условиях. Таким образом взаимодействия между карбонильными группами липидов и определенными регионами молекулы грамицидина необходимы для формирования канальой структуры (одиночной спирали).

2.9.Инженерия грамицидинового канала

Грамицидин в 90% случаев образует трансмембранный канал одной структуры, такая функциональная и химическая простота делает его уникальной моделью для изучения мембраноактивных пептидов и использования для понимания принципов пространственной организации и функционирования мембранных белков в общем и ионных каналов в частности.

Различные еденичные аминокислотные замены могут быть произведенны в грамиицидине без сильного эффекта на структуру и функцию канала [72], что позволяет проводить эксперименты по выяснению влияния конкретных аминокислотных остатков на свойства грамицидинового канала. Так же можноизучать влияние непротеиногенных (не кодируемых генетически) аминокислот [73].Более того некоторые изменения в первичной последовательности грамицидина дают каналы с качественно новыми функциями или конформациями [41].

Было показанно, что, изменяя первичную последовательность грамицидина, можно сдвигать конформационное равновесие в мембране, получая активные каналы, образованные приемущественно двухспиральными димерами. Так же, модификация первичной последовательности сильно влияет на электрофизиологические характеристики грамицидинового канала и дает возможность варьировать время жизни и проводимость канала[41].

Дальнейшие исследования различных аналогов грамицидина с измененной аминокислотной последовательностью открыли возможность получать потенциалзависимые грамицидиновые каналы. Существет два возможных пути получения каналов с такими свойствами. Первое: образование ассиметричных каналов (гетеродимеров), что влияет на энергетический профиль трансмембранного движения иона, делая его ассимметричным. Такая ассимметрия увеличивается при изменении первичной последовательности от центра канала к его входу (то есть от N- к C-концу молекулы грамицидина.

Вторым способом получения потенциалзависимого поведения грамицидинового канала является введение в его последовательность сенсора напряжения, только в данном случае эти сенсоры имеют намного меньшие размеры (одна аминокислота) чем в “больших” ионных каналах, а принцип их действия остается неизменным.

Вышеописанные исследования говорят с одной стороны о важности практически всех аминокислот, входящих в последовательность грамицидина (а не только остатков триптофана), и, с другой стороны открывают новые возможности для моделирования структуры и функции канала [41].

2.11.Общее применение в качестве модельной системы

Данные последних исследований методами дифракции ренгеновских лучей, ЯМР-, КД- и ИК – спектроскопии, а так же компьютерное моделирование и исследование химически модифицированных аналогов позволяют детально понять природу структуры грамицидинового канала и его конформационных переходов. Результатом использования такого широкого набора методов является возможность по-новому взглянуть на конформационные взамиоотношения в молекуле грамицидина и сравнить их с существующими моделями.

Оглядываясь назад, мы видим что все предложенные изначально конформационные модели являются корректными, отображают общие принципы упаковки полипептидного остова и не противоречат экспериментальным данным, что очень важно для применения в исследовании других молекул.

В качестве модели грамицидин был использован для изучения липид – белковых взаимодействий [77], ионной проводимости [78], влияния трехмерной структуры на функцию [17]. Но применять эту модель нужно очень осторожно, из-за маленьих размеров, молекула грамицидина очень подвижна и принмает множество конформаций в зависимости от внешних условий, в то время как “большие” ионные каналы, состоящие из длинных полипептидных цепей, а иногда и нескольких субъедениц, имеют довольно стабильную пространственную структуру в условиях, близких к физиологическим (или же имеют небольшие вариации прис охранении общего способа укладки полипептидной цепи). Таким образом, определяя еденичную трехмерную структуру “большого” канала мы с большой вероятностью можем сказать что эта конформация и представляет из себя активный канал.

Характеристики

Список файлов реферата