Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение.

Оглавление

1. Введение

2. Химическая природа грамицидина А и его общие свойства

3. Биологическая роль грамицидина А

4. Структура грамицидина А

4.1 Конформации грамицидина А в органических растворителях

4.2 Структура грамицидина А в липидных мембранах и мембрано- подобных средах

4.3 Влияние связывания катионов на конформацию грамицидина А

4.4 Взаимоотношения между конформационными состояниями грамицидина А и проводящими формами.

4.5 Инженерия грамицидинового канала

1. Фундаментальное и практическое значение грамицидина А

2. Выводы

3. Список использованной литературы

1. Введение

Грамицидин А известен уже более 50 лет, но до сих пор остается в центре внимания. Являясь очень простым по своей химической структуре (всего 15 аминокислот) он обладает свойством образовывать ионселективный трансмембранный канал, не уступающий по характеристикам огромным по сравнению с ним белковым каналам, которые представлены, например, в нервной системе. Возможно, он является предшественником этих самых каналов и за время эволюции “оброс” всевозможными сенсорами напряжения, селективными фильтрами и другими регуляторными элементами. Если продолжать такое сравнение, то в плане детальной трехмерной структуры так мы пока не знаем ни один другой ионный канал, и применение грамицидина А для построения всевозможных моделей и теоретических исследований стало одним из путей к детальному пониманию различных молекулярных механизмов и структурно-функциональных взаимодействий. И, пожалуй, грамицидин А является одной из лучших таких моделей.

2. Химическая природа грамицидина А и общие свойства

.

Грамицидин А входит в группу линейных полипептидов, продуцируемых бактериями Bacillus Brevis, на стадии спорообразования. Выделяют несколько особенностей данной группы пептидных антибиотиков:

1. Все 15 аминокислот входящие в состав последовательности грамицидинов являются гидрофобными;

2. В их последовательности наблюдается чередование L- и D- конфигураций аминокислот;

3. С - и N- конец грамицидинов блокированны с помощью этаноламина и формила соответственно.

Природня смесь (грамицидин D) состоит из трех основных компонентов, отличающихся одной аминокислотой в 11 положении, . Согласно этому отличию грамицидины классифицируют на: грамицидин А - в 11 положении Trp, грамицидин B - в одиннадцатом положении - Phe, и грамицидин С - в одннадцатом положении - Tyr.

Общая последовательность грамицидинов :

HCO-(L)Val-Gly-(L)Ala-(D)Leu-(L)Ala-(D)Val-(L)Val-(D)Val-(L)Trp-(D)Leu-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

X-(D)Leu-(L)Trp-(D)leu-(L)Trp-NH2CH2CH2OH

11 12 13 14 15

где Х= L-Trp для грамицидина А,

L-Phe для грамицидина В,

L-Tyr для грамицидина С.

Грамицидин А, В и С представленны в соотнощении 85:5:15 соответственно. Ко всему прочему имеется некоторая гетерогенность по первой аминокислоте: в природной смеси 90% грамицидинов имеют в первом положении Val, в то время как остальные 10% имеют Ile. Большинство начальных исследований было проведенно на этой 6-ти компонентной смеси.

Грамицидин К – имеющий ковалентно присоеденную жирную кислоту к С-концу так же был выделен в различных соотношениях, в зависимости от метода выделения.

Грамицидин S ( Советский ), так же продуцируется видом Bacillus Brevis, но является циклодекапептидом и действует по механизму ионного переносчиика (транспортера), и таким образом эта молекула не имеет отношения к линейным грамицидинам ни структурно, ни функционально.

Благодаря тому, что в последовательности грамицидина А нет ни одной заряженной аминокислоты и блокированны N- и С-конец (таким образом исключается возвожность образования цвиттер-иона при любых значениях рН), эта молекула практически нерастворима в воде ( меньше 10 мг в литре), но за то имеет сильное сродство с гидрофобному региону липидной мембраны. Грамицидин А слабо растворим в углеводородах, за то сильно во многих низших спиртах, органических кислотах и других органических растворителях, таких как: диметилсульфоксид, ацетон, диоксан и трифторэтанол. Он так же может быть растворенн в воде в присутствии лизолецитина, ганглиозидов, додецилсульфата натрия и некоторых других детергентов.

Начальные исследования грамицидина были проделанны на природной смеси, но после выяснения состава данной смеси дальнейшие эксперименты проводились на грамицидине А, как основном компоненте природной смеси.

3. Биологическая роль грамицидина А

Грамицидин играет важную роль в процессе спророобразования у Bacillus brevis, определяя формирование нормальных спор. Показано, что штаммы, деффекные по синтезу грамицидина формируют споры с повышенной термочуствительностью. Грамицидин А спецефически ингибирует экспрессию отдельных (вегетативных) генов, определяя, таким образом, переход микроорганизма в покоящуюся стадию. Механизм такой регуляции до конца не ясен, но известно, что грамицидин А препятствует образованию комплекса РНК-полимеразы с ДНК, необходимого для инициации транскрипции. Предложенно две мишени связывания грамицидина: 1) грамицидин А специфически связывается с определенным участком ДНК и препядствует транскрипции. Такой механизм похож на действие другого пептидного антибиотика - тироцидина, так же синтезируемоего Bacillus brevis, который, связываясь с молекулой ДНК, препятствует образованию комплекса РНК-полимераза/ДНК, и как следствие ингибирует экспрессию определенных генов; 2) грамицидин А связывается с определенным участком РНК-полимеразы, чо приводит к изменению ее конформации и невозможностью связывания с ДНК .

Возможно грамицидин А учавствует в сложном каскаде биохимических процессов вместе с другими антибиотиками (тироцидинысерия циклических пептидов, так же синтезируемых видом Bacillus brevis на стадии спорообразования), результатом которых является переход от вегетативного роста к споре.

Линейные грамицидины обладают антибиотическим и спермицидным эффектом направленным против грамположительных бактерий. Антибиотический эффект грамицидина определяется его способностью обрзовывать трансмембранный ионный канал, при чем этот эффект носит бактериостатический характер, что, по-видимому связано с истощением запасов АТФ, в организме на который действует грамицидин, который использует Na-K-АТФаза для востановления ионного градиента .

4. Структура грамицидина А

Не смотря на довольно простую первичную последовтельность грамицидина, определение природы его трехмерной структуры, не было стремительным и быстрым. Из-за его небольших размеров и, как следствие, сильной подвижности грамицидин, в зависимости от окружения, может существовать в виде семейства конформаций. Выделяют два основных типа структуры грамицидина: 1) Семейство двойных спиралей, предложенных Витчом (1974, [10] ) и существующих в органических растворителях; 2) Семейство одиночных спиралей, предложенных Урри [11] и существующих в липидных мембранах.

В связи с необычностью химической структуры грамицидина, связаной с чередованием конфигураций входящих в его последовательность аминокислот стандартная номенклатура не может быть применена для данной модели, так как грамицидин не формирует ни одного типа структур, имеющихся в глобулярных белках.

Анализируя спектры КД грамицидина, а так же основываясь на теоретических расчетах конформационных энергий Урри и сотр. (1971 г. [11]) постулировали существование особой вторичной структуры, названной 4(L,D)-спиралью, являющейся гибридом 4,4₁₆ и 4,3₁₄ спиралей (4,4 – количество остатков на виток, 16 – количество атомов в витке). Рамачандран и Чандрасекаран [12], базируясь в основном на конформационно-энергетических взаимодействиях независимо обнаружили такую же вторичную структуру. Позже Урри и сотр. [13] предложили другую модель конформации грамицидина - ⁶(L,D) спираль, имеющую 6,3 остатка на виток и центральную полость размером 4 Ǻ, которая больше подходит для связывания и транспорта катионов, чем полость в 1,4 Ǻ, имеющаяся в ⁴(L,D) спирали. Димер полипептидных цепей, ассоциированных конец к концу (N-конец к N-концу, С-конец к С-концу или N-конец к С-концу) с конформацией ⁶(L,D) спираль имеет размер 25-30 Ǻ и, таким образом, может пронизывать липидный бислой и образовывать трансмембранный канал (Рис1А). Каждая спираль стабилизируется 12-ю внутримолекулярныму водородными связями, а димер (при любых способах ассоциации) – при помощи 6-ти межмолекулярных водородных связей.

Альтернативной структурой, предложенной Витчом и сотр в 1974 году [10] , является двойная  - спираль, в которой два мономера закрученны друг на друга. Ассоциация между мономерами в такой спирали может быть как параллельной (), так и антипараллельной (). Расположение водородных связей в двойных спиралях грамицидна такое же как и в -слое, который, как было предположенно, и образуется сначала между двумя молекулами грамицидина, а затем сворачивается в спираль. Витч и сотр. Так же предложили, что такие спирали с 6-7 остатками на виток будут иметь размеры, подходящие для пронизывания липидного бислоя и транспорта ионов. Дальнейшие исследования такого типа моделей показали возможность существования антипараллельных двойных спиралей с 5,6 и 7,2 остатка на виток (рис1Б).

Рисунок 1.

Схематическое изображение спиральных димеров (структура Урри) (А) и двухспиральных димеров (структура Витча) (В) грамицидина.

Название -спираль, предложенное вначале для описания конформаций грамицидина было не совсем корректным, так как это название обычно используется для 4,4₁₆-спиралей, имеющих типичную ориентацию водородных связей ( все амидные группы пептидного остова в данной структуре обращены в оддну сторону, что в результате дает сильный суммарный диполь) , в то время как спирали предложенные для грамицидина не имеют такую геометрию (аминогруппы пептидного остова имеют различное направление, не образуя, таким образом, диполь). Ко всему прочему значения углов  и , расчитанные для данных структур, отличаются от таковых в -спиралях описанных Рамачандраном и Рамакришнаном [14]. Таким образом предложили называть такие структуры -спиралями, что лучшим образом определяет образование водородных связей.

Не смотря на явные различия двух предложенных структур, спиральные димеры (-спирали) и двухспиральные димеры (спирали) имеют много общего и могут образовывать структуры почти идентичных размеров, и, более того, способ образования водородных связей одинаков в обоих случаях. Первичная последовательность грамицидина не делает жестких ограничений для направления закручивания спиралей, и они могут быть как право- , так и левозакрученными. Этот потенциальный полиморфизм связан с тем, что чередование L- и D-аминокислот не накладывает жестких ограничений на направление закрутки спирали. Так же, в обоих типах предложенных структур, боковые цепи аминокислон располагаются с наружней стороны спирали и ни одной боковой цепи нет во внутренней полости. В результате внутренняя полость (пора ) данных спиралей намного больше таковой для -спиралей. Это связанно с природой β-слоя: в последовательностях имеющих только L-аминокислоты, при образовании -слоя боковые цепи обращены поочередно в разные стороны от плоскости слоя, а в случае чередования L- и D-аминокислот все боковые радикалы будут обращены в одну сторону от плоскости β-слоя и , таким образом при сворачивании такой структуры в спираль они все окажутся снаружи, а внутри образуется пора , выстланная карбонильными группами пептидных связей, способная пропускать воду и ионы.

2.3.Конформация грамицидина А в растворе

Грамицидин принимает несколько типов конформаций в органических растворителях. Витч и сотр. [10, 15, 16] обнаружили, что диоксане грамицидин существует в виде 4-х различных форм, переходящих друг в друга и находящихся в медленном равновесии (время перехода одной формы в другую измеряется часами). Все четыре формы были разделены методом тонкослойной хроматографии, при чем каждая отдельная форма, выделенная с тонкослойной пластинки и нанесенная заново, опять проявлялась в виде четырех пятен. Различные формы не показали различий в первичной структуре. Данные осмометрии и флуресценции [16], показали, что каждая из четурех форм является димером. Методом ИК-спектроскопии [10] было показанно, что все формы являются двойными спиралями, при чем формы 1,2 и 4 ( пронумерованны согласно их хроматографической подвижноси) являются параллельными двойными спиралями, а форма 3 – антипараллельной двойной спиралью [10]. Каждый из видов имеет характерный КД-спектр, дающий информацию о направлении закручивания спирали. Так как спектры видов 1 и 2 имеют одинаковую форму, Витч и сотр. предложили, что они имеют одинаковое направление закручивания [10]. Формы 1,2 и 3 имеют отрицательную эллиптичность в области 205-240 нм, направление закручивания спиралей является противоположной по сравнению с видом 4, форма спектра которого представляет собой зеркальное отображение видов 1,2 и 3.

Спектр грамицидина, полученный сразу после растворения кристаллов представляет собой спектр формы 3 [10]. Спектр равновесной смеси форм представляет собой наложение спектров отдельных форм, но за счет того, что спектры 1,2 и 4 практически взаимовычитают друг друга, он имеет форму вида 3 , даже если она находиться в незначительном количестве по отношению к другим.

КД спектроскопия не дает детальной информации о конформации каждой структуры, из-за того, что  и  углы в -спиралях отличаются от таковых в -спиралях, -слоях и -поворотах, что делает сравнение данных спектров со спектрами других белков не эффективным.