11406 (Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе), страница 5

Основными причинами, ограничивающими широкое использование регуляторных пептидов в клинике являются: слабовыраженный эффект при приеме внутрь, зависимость эффекта от исходного функционального состояния организма, трудности при прохождении ГЭБ, а также кратковременность действия, обусловленная в основном их быстрым протеолизом. Одним из наиболее известных препаратов, устойчивым к действию пептид-гидролаз, обладающим селективным пролонгированным действием, а также биодоступным, является даларгин - аргининсодержащий гексапептидный аналог лей- энкефалина ( Д-ала²-лей⁵-арг⁶-энк ) [69, 94, 105, 123, 146]. Внутримышечное введение его стимулирует репаративную регенерацию периферических нервных образований в условиях их повреждения, повышает активность коры надпочечников при стрессе [34], положительно влияет на организм после перенесенного инфаркта миокарда, симптоматика которого сходна с изменениями, возникающими в организме, подверженном острому эмоционально-болевому стрессу [245]. Показана также возможность использования даларгина для профилактики и патогенетической коррекции стресс-индуцированных нарушений иммунитета [148]. Выраженное антистресорное действие аргининсодержащего гексапептидного аналога обусловлено наличием аргининового компанента [101]. Важное значение в механизмах действия даларгина при стрессе имеет стимулирующее влияние его на опиатные рецепторы нейрональных структур мозга, а также на тормозную ГАМК-эргическую систему [101, 146]. Обнаруженные эффекты способствуют ограничению стресс-реакции на стадии тревоги и формированию резистентности к действию стресса в ходе общего адаптационного синдрома [89, 101].

Таким образом, экспериментально и теоретически доказана значимость системы опиоидных пептидов в адаптации и устойчивости организма к стрессу. Одним из важных, и в то же время малоизученных, вопросов в понимании механизмов регуляции активности нейропептидов в организме при воздействии стресса является выяснение путей их синтеза и деградации при экстремальных условиях.

1. ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРИ СТРЕССЕ

В настоящее время протеолиз рассматривается не только как процесс катаболической утилизации биологически активных пептидов, но и как регуляторный фактор, функция которого состоит в запуске и прерывании ряда биохимических и физиологических процессов при различных функциональных состояниях организма [22, 77, 177, 226]. Практически неизученным остается вопрос об изменениях в функции ферментов обмена нейропептидов при стрессе, в то время как именно активность этих ферментов определяет уровень биологически активных пептидов в организме и, следовательно, степень реализации ответной реакции организма на воздействие экстремальных факторов.

Согласно литературным данным характер изменения активности ферментов обмена нейропептидов при стрессе зависит от эмоционального статуса животного, который в свою очередь определяется генетически запрограммированной предрасположенностью к той или иной форме экспериментальных неврозов [22, 48, 80, 83, 138, 210, 236]. Исследования показывают, что у крыс с различным поведением в тесте “открытого поля” наблюдаются различия в уровне катехоламинов в мозге [232]. Поскольку регуляция функций САС при стрессе реализуется при участии опиоидных пептидов, способных влиять на направление адаптивных процессов в организме [139, 146], то не исключается, что устойчивость к стрессу зависит от функциональной активности ферментов обмена опиоидных пептидов.

Подобная зависимость отмечена для КПН, АПФ, КПN при эмоциональном стрессе [43, 44]. Отмечено, что у устойчивых к стрессу животных активность ферментов обмена нейропептидов более чувствительна к воздействию эмоционального стресса, чем у предрасположенных.

Обнаружено, что у устойчивых к стрессу животных в гипоталамусе и стриатуме активность КПН при воздействии стресса повышается [41, 42, 43, 56]. Авторами высказано предположение, что такой эффект наблюдается в связи с активацией синтеза в исследованных отделах нейропептидов (энкефалинов, вещества Р и др.), играющих ключевую роль при адаптации к стрессу. В гипофизе, где синтезируется АКТГ, активность растворимой фракции КПН, напротив, существенно повышалась у предрасположенных к стрессу животных. Предполагается, что причина отмеченных изменений состоит в том, что КПН участвует в процессинге АКТГ, который в свою очередь усиливает чувство страха и тревоги и тем самым усугубляет эмоциональный стресс [189].

Известно, что КПN и АПФ также участвуют в обмене ПВДС, -эндорфина [40, 209], уровень которых различен у предрасположенных и устойчивых к стрессу животных [92, 130,131]. Повышение содержание этих пептидов в мозге и крови у животных связывают, прежде всего, с высокой скоростью их обмена. Показано, что у устойчивых к эмоциональному стрессу животных, активность КПN и АПФ в сыворотке крови выше, чем у предрасположенных [44]. В связи с этим, авторами высказано предположение о более интенсивном обмене нейропептидов у этих животных и косвенном влиянии КПN и АПФ на эмоциональный статус организма [44].

Немаловажную роль в изменении функциональной активности ферментативных систем мозга и периферических тканей при стрессе играет вид стресс-воздействия (хронический и острый звуковой, иммобилизационный, эмоционально-болевой и т.д.).

Такая зависимость показана, в частности, для КПН [37, 41, 42, 43, 45, 64]. Активность данного фермента при воздействии стресса различной природы, в основном, повышалась, однако, степень ее повышения была различной, что обуславливают спецификой воздействия, вызывающего стресс. Так при хроническом эмоционально-болевом стрессе (ЭБС) повышение активности фермента было меньшим, чем при остром воздействии стресс-факторов [37, 42]. Кроме того, показано, что повышение активности фермента было различным для растворимой и мембраносвязанной форм КПН, что свидетельствует о различной роли этих форм фермента в организме [45, 186]. Наиболее выраженными изменения активности фермента были в гипофизе - отделе, отвечающем за синтез и секрецию стресс-пептидов [37, 45]. Значительное повышение активности показано также в стриатуме – отделе, где синтезируется ряд биологически активных пептидов стресс-протективного действия. Причем отмечено, что при однократном ЭБС такое повышение активности сохранялось в течение достаточно длительного промежутка времени, что указывает, на длительный характер биосинтеза нейропептидов при оказанном воздействии. Предполагается, что причина различия в динамике изменения активности КПН при остром и хроническом воздействии стресса состоит в развитии адаптации организма к неблагоприятным факторам среды при хроническом (многократном) стресс-воздействии [37].

Особый интерес представляют исследования, касающиеся влияния различных веществ на ферменты обмена нейропептидов при стрессе. Известно, что этанол ослабляет некоторые физиологические проявления стресса, усиливает секрецию стресс-пептидов, а так же активирует энкефалинэргическую систему [19, 41]. Поскольку уровень опиоидных и стресс-пептидов в организме контролируется КПН, то представляется возможным, что КПН определяет характер влияния этанола на организм при стрессе [19, 41]. Характер влияния этанола на физиологические проявления стресса связан с особенностями стрессирующего фактора [61]. Сведения о гиперактивации КПН при совместном действии этанола иммобилизационного или хронического ЭБС в отделах мозга, где синтезируются опиоидные пептиды, вещество Р, подтверждают данные об адаптогенном действии этанола при стрессе. Однако такая активация пептидэргических систем ведет к тяжелым последствиям для организма, так как вызывает более быстрое истощение этих систем [41].

Дальнейшее изучение механизмов, предотвращающих возникновении стресс-реакции, способствовало поиску новых веществ, обладающих стресс - протективным действием. Особое место в ряду таких веществ отводится транквилизаторам (резерпин, диазепам), которые широко используются в клинической практике. Однако влияние их на пептидэргические системы и ферменты обмена нейропептидов изучено недостаточно. Между тем этот вопрос достаточно важен, для понимания механизмов развития стресса.

Известно, что резерпин повышает уровень энкефалинов в организме [58]. При введении резерпина, активность ферментов процессинга, обладавших КПБ-подобной активностью (КПН и КПN), повышалась в 2-3 раза [58]. Предполагается, что изменение активности изучаемых ферментов является причиной активизации энкефалинэргической системы.

Транквилизаторы бензодиазепиновой природы также обладают стресс - протективным действием. Изучение их воздействия на ферменты обмена нейропептидов при стрессе становится тем более интересным, что в цепи реакций, которые они осуществляют в организме есть вещества, которые являются либо продуктами их деятельности, либо они участвуют в регуляции их синтеза. Так бензодиазепиновые транквилизаторы модулируют уровень АКТГ как в норме так и при воздействии стресс-факторов [114, 252], в частности введение фенозепама уменьшает концентрацию АКТГ при стрессе. Поскольку известно, что КПН участвует в биосинтезе АКТГ, то особый интерес представляет изучение возможности вовлечения этого фермента в стресс-протективное действие транквилизаторов.

Данные исследований показывают, что активность КПН при совместном воздействии диазепама и стресса, в основном, ниже, чем только при стрессе [39]. Активность АПФ в сыворотке при введении диазепама изменяется сходным образом. Поскольку АПФ участвует в деградации энкефалинов, вещества Р и ПВДС - биологически активных пептидов, основная роль которых заключается в адаптации организма к стрессу [107, 135, 152], то не исключается, что антистрессорное действие диазепама обусловлено его модулирующим действием на активность КПН и АПФ. Изменение активности данных ферментов может привести к уменьшению содержания АКТГ и увеличению содержания опиоидных нейропептидов, способствуя тем самым развитию адаптационных реакций в организме.

Таким образом, изменения в проявлении функциональной активности ферментов процессинга и инактивации биологически активных пептидов при стрессе свидетельствуют о важной роли этих ферментов в регуляции уровня активных нейропептидов, участвующих, как в развитии, так и в торможении размаха стресс-реакции.

Суммируя вышеизложенные сведения необходимо отметить следующее:

1. Опиоидные пептиды, их синтетические аналоги (например, даларгин), а также предшественники (лей⁵-энкефалин-арг⁶) обладают стресс-протективным свойством.

2. При воздействии на организм стресс-факторов различной природы наблюдаются значительные изменения в обмене биологически активных пептидов, а также жизнедеятельности организма в целом. Наиболее существенные изменения отмечаются при остром стресс-воздействии.

3. Важная роль в обмене регуляторных пептидов принадлежит ферментам пептид-гидролазам, которые регулируют уровень биологически активных пептидов при различных функциональных состояниях организма, в том числе и при стрессе. Особое место в ряду этих ферментов занимают основные карбоксипептидазы, которые действуют на конечном этапе процессинга предшественников регуляторных пептидов, а также ферменты, участвующие в инактивации активных форм нейропептидов.

4. Стресс-протективные вещества различной природы влияют на активность ферментов обмена нейропептидов мозга и периферических тканей стрессированных животных, что свидетельствует об изменениях в метаболизме нейропептидов у этих животных.

В связи с этим, представляет интерес изучение влияния предшественника лей-энкефалина на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов головного мозга и периферических тканей животных, подверженных воздействию острого ЭБС. Полученные данные могут способствовать выяснению роли пептидгидролаз в механизмах развития стресс-реакции, а также в реализации эффектов экзогенного предшественника на организм, подверженный стрессу.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили головной мозг и периферические ткани (надпочечники и семенники) самцов белых беспородных крыс в возрасте 5 месяцев, массой 160-190 г. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.

Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и семенники. Затем ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус, средний мозг, гиппокамп, стриатум, большие полушария.

Образцы выделенных отделов мозга и тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном (NaAc) буфере рН 5,6, содержащем 50 мМ NaCl. Соотношения вес/объем были различны: 1/400- для гипофиза, 1/200- для надпочечников, 1/100- для семенников, 1/50- для отделов мозга. Гомогенаты использовали в качестве источников КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ.

В работе были использованы 4 группы животных. 1 группа – интактные животные. Животным 2 группы вводили раствор лей⁵-энкефалин-арг⁶ в дозе 20 мкг/кг соответственно. Животные 3 группы подвергались воздействию острого ЭБС. Животным 4 группы перед воздействием острого ЭБС инстиллировали на конъюнктиву глаза 2 мкл раствора предшественника лей-энкефалина - лей⁵-энкефалин-арг⁶ в дозе 20 мкг/кг.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина

Введение предшественника лей-энкефалина - тир-гли-гли-фен-лей-арг (лей-энкефалин-арг) осуществлялось способом инстилляции на конъюнктиву глаза (доза 20 мкг/кг веса). Раствор лей-энкефалин-арг наносился на правый глаз крысы, с помощью дозатора с мягким катетером из поливинилхлорида (объем наносимого раствора 2 мкл). Введение предшественника энкефалина осуществлялось утром в одно и то же время.

Раствор лей-энкефалин-арг был приготовлен на физиологическом растворе.