91771 (Клініко-імунологічне обґрунтування комплексної терапії хронічного обструктивного захворювання легенів у хворих, які перенесли туберкульоз легенів), страница 2

Методи дослідження. Всім особам, які брали участь в дослідженні, проведене комплексне обстеження. Воно включало збір анамнезу, огляд, виявлення фізікальних змін, лабораторні дослідження. Діагноз встановлювався на підставі даних комплексного клініко-рентгенологічного обстеження, з урахуванням показників функції зовнішнього дихання. Вимірювання і реєстрація параметрів зовнішнього дихання, включаючи спірограму, пневмотахограму, потік-об'ємну діаграму з автоматичним розрахунком пульмонологічних показників здійснювалися на комп'ютеризованому комплексі "ТОН-I" випуску Харківського науково-виробничого об'єднання ТОН.

Досліджували: рівень цитокінів IL-1в і IL-4 в сироватці крові і культуральному середовищі культури клітин епітелію бронхів імуноферментним методом з використанням комерційних наборів (ТОВ "Цитокіни" IL-1, протеїновий контур – TNF-, IL-4). Визначення вмісту тестостерону в плазмі крові здійснювалося за допомогою набору “Testosterone EIA COBAS CORE” методом імуноферментного аналізу на фотометрії. Визначення концентрації ФСГ в сироватці крові проводилося методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням набору реагентів ФСГ ІФА “Діаплюс” (Москва). Кількісне визначення концентрації ЛГ в сироватці крові проводилося методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням набору реагентів ЛГ ІФА “Діаплюс” (Москва). Визначення вмісту естрадіолу в плазмі крові здійснювалося за допомогою набору “Estradiol EIA COBAS CORE” методом імуноферментного аналізу.

Для визначення рівня експресії антигена CD14 на CD19+-лімфоцитах (В-лімфоцитах) зразки фарбували в прямому двобарвному імунофлуоресцентному тесті моноклональними антитілами Anti-Leu-M3, міченими флуоресцеїнізотиоціанатом і Anti-Leu-12, міченими фікоеритрином (Becton Dickinson). Вивчення впливу тестостерону і плацентарного гормону на експресію лімфоцитами CD14+-рецепторів здійснювалося в серії експериментів: дослід 1(CD14+): суспензія мононуклеарів визначення CD14+; дослід 2(CD14+): суспензія мононуклеарів інкубація клітин з 6,0 нг/мл людського тестостерону (SIGMA, США) в середовищі 199 протягом 30 хвил в термостаті при 37^оС відмивання клітин визначення CD14+; дослід 3(CD14+): суспензія мононуклеарів інкубація клітин з 12,0 ОД/мл розчину хоріонічного гонадотропіну в середовищі 199 протягом 30 хвил в термостаті при 37^оС відмивання клітин визначення CD14+.

Досліджували неспецифічну і ендотоксин (ліпополісахарид) –індуковану хелперну і супресорну функціональну активність лімфоцитів [Moller G. et al., 1978]. Вивчення впливу тестостерону і плацентарного гормону на функціональну активність лімфоцитів також здійснювалося в серії експериментів з преінкубацією клітин з гормонами в середовищі 199 протягом 30 хвил в термостаті при 37^оС з подальшим відмиванням клітин і визначенням відповідного показника.

При вивченні специфічного гуморального імунітету визначали вміст антиендотоксинових антитіл до ЛПС E.coli у сироватці крові. При визначенні антиендотоксинових антитіл як антиген використовували ЛПС грамнегативної ентеробактерії Escherichia coli K30 (О9:К30:Н12), виділений з бактерійної біомаси методом водно-фенолової екстракції і додатково очищений від домішок РНК обробкою цетавлоном ("Serva", Німеччина). Сироваткові антиендотоксинові антитіла до гліколіпіду Salmonella minnesota Re595 визначали методом тІФА [Гордиенко А.И. и соавт., 2004]. Визначення циркулюючих комплексів ЛПС - ФН проводилося із застосуванням "сендвич"-ваpіанта тІФА.

Для культивування мононуклеарних лейкоцитів і визначення впливу на функціональну активність клітин гормонів репродуктивної сфери використаний модифікований метод короткострокових органних культур [Лурія Е.А., 1972].

Враховуючи, що клітини ендотелію отримували в основному з мікроциркуляторного русла зразків тканин легенів, отриманих intra operationem, нами використана методика виділення ендотеліальних клітин [Ryan U.S., Ryan J.W., 1980]. Ендотеліальні клітини в моношаровій культурі культивували протягом 2-х діб [Patel J., Block E., 1993]. З ендотеліальними клітинами легеневих судин осіб контрольної групи паралельно проводилися декілька експериментів, включаючи культивацію із введенням суспензії мононуклеарів хворих 1-ої і 2-ої груп, а також введенням суспензії мононуклеарів після преінкубації клітин з 6,0 нг/мл людського тестостерону, 12,0 ОД/мл розчину хоріонічного гонадотропіну і 20 мкг/мл ЛПС грамнегативної ентеробактерії Escherichia coli K30 (О9:К30:Н12), "Serva", Німеччина).

У культуральних експериментах по завершенню культивування визначалася також фібринолітичну активність [Astrup T., Mullertz S., 1972] культурального середовища культури ендотеліальних клітин, фібринолітична (активаторна) активність за еуглобуліновим тестом [Januszko T., Dubinska L.,1965; Скипетров В.П. и соавт., 1978], а також прокоагулянтна активність культурального середовища культури клітин [Bergerhof H., Roca L., 1954].

Активність ЧВ визначали за ристоміцин-індукованій агрегації формалінізованих тромбоцитів [Поливода С.М. и соавт., 1999]. Визначення вмісту Et-1 в плазмі крові проводили за допомогою імуноферментного набору фірми "Amersham Pharmacia Biotech" і колонок для афінної хроматографії тієї ж фірми.

Результати власних досліджень та їх обговорення. ХОЗЛ – одне з найпоширеніших хронічних захворювань органів дихання, яке не дивлячись на лікування, що проводиться, зазвичай поволі, але неухильно прогресує. Необхідно підкреслити, що в сучасних протоколах лікування різних форм НЗЗЛ мають місце істотні відмінності. Так, враховуючи центральну патогенетичну роль імунного (імунопатологічного) запалення, в лікуванні хворих на бронхіальну астму центральне місце відводиться протизапальному ефекту глюкокортикоїдів. У хворих на ХОЗЛ загострення патологічного процесу також запального генезу, але, на відміну від бронхіальної астми, воно не носить чіткого імунопатологічного характеру. Тому стероїдні глюкокортикоїдні гормони в терапевтичних програмах з ХОЗЛ не займають провідне місце. Протизапальна ж дія М-холіноблокаторів (основних базисних препаратів, що використовуються в лікуванні ХОЗЛ) при загостренні, а також при важких і швидко прогресуючих формах захворювання, явно недостатня. Так, наприклад, при загостренні важких форм ХОЗЛ у стаціонарі проводиться так звана "інтенсивна" терапія (що включає масивну інфузійну дезінтоксикаційну терапію, корекцію pH, лікування серцевої недостатності, антибактеріальну терапію за показаннями тощо), яка нерідко переходить в дії реанімаційного характеру. Тому від успішної ліквідації оборотного запального патогенетичного "компоненту" у фазі нестійкої ремісії, а також при загостренні ХОЗЛ у ряді випадків безпосередньо залежить прогноз захворювання і життя хворого. Таким чином, пошук нових шляхів підвищення ефективності лікування хворих на ХОЗЛ продовжує представляти, на нашу думку, дуже важливу проблему сучасної пульмонології.

Особливі надії на вирішення проблеми хронічного запалення в клінічній практиці в останнє десятиліття пов'язують з розробкою нових методів селективного впливу на найбільш важливі ланки імунопатогенезу захворювань, включаючи біологічні модифікатори імунної відповіді – антизапальні цитокіни, моноклональні антитіла, антагоністи рецепторів, розчинні рецептори [Breedveld F., 2000; Lorenz H., Kalden J., 2002]. Серйозною проблемою використання "антицитокінів" (etanercept, infliximab, adalimumab) в практичній пульмонології стала реактивація прихованої туберкульозної інфекції, що фактично виключає можливість їх використання у осіб, котрі перенесли туберкульоз різної локалізації [Hamdi H. et al., 2006]. При цьому нами враховувалося, що в одиничних роботах документована пряма антицитокінова активність не тільки глюкокортикоїдів, але і гормонів репродуктивної сфери [Pugh P. et al., 2002; Ferreira A., 2004]. З урахуванням вищесказаного, за своєрідну "точку відліку" при формуванні груп порівняння нами вибрана не тільки анамнестична вказівка на перенесений туберкульоз легенів, але враховувався також рівень ендогенного тестостерону (у хворих чоловічої статі, котрі страждають на ХОЗЛ).

Так, нами встановлено (табл. 1), що у хворих 1-ї групи перебіг ХОЗЛ I-II ступеня тяжкості (без вказівок на перенесений туберкульоз в анамнезі) характеризується фізіологічним рівнем секреції ендогенного тестостерону, а також ФСГ, ЛГ і естрадіолу. У хворих на ХОЗЛ I-II ступеня тяжкості, котрі перенесли різні форми туберкульозу легенів (2-а група хворих), формується ендокринний дисбаланс – еугонадотропний гіпогонадизм. При цьому відсутність пониженого синтезу ендогенного тестостерону (дисфункція стероїдогенезу) у хворих 1-ї групи дозволяє виключити зміни в тестикулах, пов'язані з ХОЗЛ.

Таблиця 1

Рівень гормонів репродуктивної сфери в периферичній крові у хворих 1-ї і 2-ї груп

Примітка: р – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з групою здорових осіб,

р₁ – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з 1-ю групою хворих.

Встановлено також (табл. 2), що підвищення рівнів прозапального цитокіну IL-1в в системному кровотоку має місце у хворих на ХОЗЛ як 1-ї, так і 2-ї груп. При цьому, якщо у хворих 1-ї групи досліджений показник підвищений на 17,8 %, то у хворих 2-ї групи – на 34,1%, що також статистично значущо вище, ніж у хворих 1-ї групи. Рівень IL-4 в сироватці крові у хворих 1-ї групи не виходить за межі діапазону його фізіологічних коливань, а у хворих 2-ї групи – підвищений на 13,5 %, що також достовірно вище, ніж у хворих 1-ї групи. У хворих 1-ї групи виявлено достовірне підвищення рівня TNF-б на 22,2 %, у хворих 2-ї групи – на 56,8 %.

Таблиця 2

Рівень цитокінів у сироватці крові у хворих 1-ї і 2-ї груп, пг/мл

Примітка: р – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з групою здорових осіб,

р₁ – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з 1-ю групою хворих.